HIF-1對(duì)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的初步探討.pdf

1、目的：觀察缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)的活性與靶基因表達(dá)的變化，探討其對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)損傷的影響。 方法：取(1～3d)SD乳鼠心臟并分離培養(yǎng)成心肌細(xì)胞；觀察心肌細(xì)胞生長(zhǎng)情況，分別以臺(tái)盼藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞活力及鑒定其純度。于培養(yǎng)的第3天將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組(每組重復(fù)6次)，包括：①正

2、常對(duì)照組，②缺氧/復(fù)氧(H/R)組，③甲基乙二?；拾彼?DMOG+H/R)組；建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，以脯氨酸羥化酶的抑制劑—甲基乙二?；拾彼?DMOG)進(jìn)行干預(yù)。觀察各組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率；應(yīng)用酶免疫法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的肌鈣蛋白I(cTnI)含量；采用RT—PCR法檢測(cè)各組HIF-1α及下游因子血紅素氧合酶-1(HO-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT-1)mRNA水平；采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)

3、驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)的表達(dá)；進(jìn)行脯氨酸羥化酶(P4HA2)小干擾RNA(siRNA)載體的構(gòu)建。 結(jié)果：分離1只乳鼠所獲得的心肌細(xì)胞產(chǎn)量約為140萬(wàn)個(gè)，且心肌細(xì)胞活力為90％以上，純度達(dá)95％。培養(yǎng)4～6h的乳鼠心肌細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，12～24h明顯增殖，3～4d后細(xì)胞融合成片；心肌細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮巍⑿切?、多角形，并出現(xiàn)自

4、發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng)。與正常對(duì)照組相比，H/R組、DMOG+H/R組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率均明顯減少(P<0.01)；而DMOG+H/R組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率又較H/R組明顯升高(P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，H/R組、DMOG+ H/R組的cTnI含量和ICAM-1表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，且HIF-1α、HO-1、VEGF、GLUT-1 mRNA水平亦明顯增高(P<0.01、P<0.05)。與H/R組相比，DMOG+H/R組心肌細(xì)胞

5、HIF-1α、HO-1、VEGF、GLUT1mRNA水平明顯增高，而cTnI含量和ICAM-1表達(dá)水平則明顯降低(P<0.05)。完成P4HA2siRNA慢病毒載體構(gòu)建。 結(jié)論：DMOG干預(yù)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可以使HIF-1在mRNA水平穩(wěn)定表達(dá)；HIF-1的穩(wěn)定表達(dá)可以促進(jìn)下游靶基因HO-1、VEGF、GLUT1mRNA的表達(dá)；與H/R組相比，DMOG干預(yù)組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率明顯升高且心肌細(xì)胞cTnI含量和ICAM-1含量有所