人參皂甙Rb1與Rg1在培養(yǎng)腎小管細(xì)胞缺氧復(fù)氧性損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NormalRatProximalTubularEpithelialCells，NRK52E)缺氧復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，HRO)損傷體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，研究人參皂甙(Ginsenosides，GS)的2種單體成分Rb1和Rg1在培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞HRO損傷中的作用，并探討其機(jī)制。 方法：①建立體外培養(yǎng)腎小管細(xì)胞HRO損傷模型將培養(yǎng)的細(xì)胞放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，先將培養(yǎng)箱抽真空

2、，再持續(xù)通入氮?dú)狻７謩e于缺氧6h、12h和24h時取出細(xì)胞放入5％CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24h。②培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗參數(shù)的確定用MTT法測定體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞的OD值以判定其增殖活性。繪制腎小管細(xì)胞的生長曲線，確定細(xì)胞最適接種密度和實(shí)驗處理時間。通過不同時間缺氧復(fù)氧和不同濃度(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml)的Rb1或/和Rg1引起的腎小管上皮細(xì)胞增殖活性的改變及細(xì)胞形

3、態(tài)學(xué)的改變，確定適宜缺氧復(fù)氧時間和最佳藥物濃度。③人參皂甙Rb1和Rg1在培養(yǎng)大鼠腎小管細(xì)胞HRO損傷中的作用及機(jī)制的探討實(shí)驗分組對照組(controlgroup)，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM，5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；缺氧復(fù)氧組(HRO組)，培養(yǎng)液為含10％FBS的DMEM，厭氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)12h，然后于5％CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24h(下同)；人參皂甙Rb1+缺氧復(fù)氧組(Rb

4、1+HRO組)，培養(yǎng)液為含5μg/ml(最佳藥物濃度)Rb1和10％FBS的DMEM，進(jìn)行HRO培養(yǎng)；人參皂甙Rg1+缺氧復(fù)氧組(Rg1+HRO組)，培養(yǎng)液為含5μg/ml(最佳藥物濃度)Rg1和10％FBS的DMEM，進(jìn)行HRO培養(yǎng)；人參皂甙Rb1+人參皂甙Rg1+缺氧復(fù)氧組(Rb1+Rg1+HRO組)，培養(yǎng)液為含5μg/ml(最佳藥物濃度)(Rb1+Rg1)和10％FBS的DMEM，進(jìn)行HRO培養(yǎng)。以上各組腎小管細(xì)胞接種密度為5×1

5、04/ml，常規(guī)培養(yǎng)24h然后用無血清培養(yǎng)液同步化12h，然后依上述分組處理方法培養(yǎng)36h，最后用MTT法檢測腎小管細(xì)胞活性(OD值)以判定各組細(xì)胞增殖狀況；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)表達(dá)情況；分光光度計比色法檢測培養(yǎng)液中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)含量和細(xì)胞內(nèi)超氧化

6、物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性。 結(jié)果：①正常腎小管細(xì)胞生長增殖狀況腎小管細(xì)胞最適接種密度為5.0×104/ml，接種后培養(yǎng)48h～72h時生長迅速，培養(yǎng)至72h時細(xì)胞增殖最為活躍，之后生長速度逐漸變慢。②缺氧復(fù)氧對正常腎小管細(xì)胞活性的影響隨缺氧時間延長，復(fù)氧后OD值越來越低。缺氧6h復(fù)氧24h組同對照組的OD值比較差異無顯著性(P＞0.05，下同)；缺氧12h復(fù)氧24h組和缺氧24h復(fù)氧24h組

7、分別同對照組比較OD值均減小，差異均具有顯著性(P＜0.01)。正常培養(yǎng)腎小管細(xì)胞呈鋪路石樣，貼壁生長，排列緊密。缺氧6h復(fù)氧24h組腎小管細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞生長抑制亦不明顯。隨缺氧時間延長，復(fù)氧后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同程度的改變，細(xì)胞皺縮變圓或破裂甚至壞死脫落。缺氧24h復(fù)氧24h組大部分細(xì)胞發(fā)生上述形態(tài)改變。③不同濃度Rb1或/和Rg1對正常腎小管細(xì)胞增殖活性的影響2.5μg/ml～25ug/mlRb1組同對照組比較均有促進(jìn)細(xì)胞增殖

8、作用，差異均具有顯著性(P＜0.05)，其中以5μg/mlRb1促增殖作用最強(qiáng)；50μg/mlRb1組同對照組比較差異無顯著性；75μg/mlRb1則顯示明顯抑制作用(P＜0.01)。2.5μg/ml～25μg/mlRg1組分別同對照組比較均有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，差異均具有顯著性(P＜0.05)，其中以5μg/mlRg1促增殖作用最強(qiáng)；50μg/mlRg1組同對照組比較差異無顯著性；75μg/mlRg1則顯示明顯抑制作用(P＜0.01)。

9、2.5μg/ml～50μg/ml(Rb1+Rg1)組分別同對照組比較，均有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，差異均具有顯著性(P＜0.01)，其中以5μg/ml(Rb1+Rg1)組促增殖作用最強(qiáng)；75μg/ml(Rb1+Rg1)則顯示抑制作用(P＜0.05)。在2.5μg/ml～25μg/ml范圍內(nèi)(Rb1+Rg1)對腎小管細(xì)胞促增殖作用均強(qiáng)于相應(yīng)濃度的Rb1或Rg1，差異均具有顯著性(P＜0.05)。④Rb1或/和Rg1對HRO處理的腎小管細(xì)胞增殖活

10、性的影響HRO組同對照組比較OD值減小，差異具有顯著性(P＜0.01)。Rb1+HRO組、Rg1+HRO組和Rb1+Rg1+HRO組分別同HRO組比較OD值均增加，差異均具有顯著性(P＜0.05)。Rb1+Rg1+HRO組的OD值分別高于Rb1+HRO組和Rg1+HRO組，差異均具有顯著性(P＜0.05)。Rb1+Rg1+HRO組同對照組比較差異無顯著性。⑤Rb1或/和Rg1對HRO處理的腎小管細(xì)胞中PCNA表達(dá)的影響PCNA定位于細(xì)胞

11、核，陽性染色呈紅色。Rb1或/和Rg1作用后，胞核著色較HRO組明顯加深。HRO組同對照組比較PCNA陽性表達(dá)率降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。Rb1+HRO組、Rg1+HRO組和Rb1+Rg1+HRO組分別同HRO組比較，PCNA陽性表達(dá)率均升高，差異均具有顯著性(P＜0.05)，其中以Rb1+Rg1+HRO組表達(dá)最強(qiáng)。Rb1+HRO組和Rg1+HRO組比較差異無顯著性。⑥培養(yǎng)液中的MDA、LDH含量和腎小管細(xì)胞內(nèi)的SOD活力的

12、變化HRO組同對照組比較培養(yǎng)液中MDA含量明顯升高，差異均具有顯著性(P＜0.01)；Rb1+HRO組、Rg1+HRO組和Rb1+Rg1+HRO組分別同HRO組比較，培養(yǎng)液中MDA含量均降低，差異均具有顯著性(P＜0.05)；對照組、Rb1+HRO組、Rg1+HRO組和Rb1+Rg1+HRO組之間相互比較差異無顯著性。HRO組同對照組比較腎小管細(xì)胞內(nèi)的SOD活力明顯降低，差異具有顯著性(P＜0.01)；Rb1+HRO組、Rg1+HRO組

13、和Rb1+Rg1+HRO組分別同HRO組比較，腎小管細(xì)胞內(nèi)的SOD活力均增高，差異均具有顯著性(P＜0.05)，其中以Rb1+Rg1+HRO組最高；Rb1+HRO組同Rg1+HRO組比較差異無顯著性。HRO組同對照組比較培養(yǎng)液中的LDH含量明顯增加，差異具有顯著性(P＜0.01)；Rb1+HRO組、Rg1+HRO組和Rb1+Rg1+HRO組分別同HRO組比較，培養(yǎng)液中的LDH含量均減少，差異均具有顯著性(P＜0.05)；前四組之間相互比