卵巢癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志候選蛋白CDC50A的篩選及其干細(xì)胞特性鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病，晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）患者的5年生存率始終徘徊在20％～30%。在理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療是臨床規(guī)范化的治療手段。然而，化療的原發(fā)或者繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是卵巢癌治療中的主要障礙，也是晚期患者五年生存率較低的主要原因。深入認(rèn)識腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、以及耐藥性產(chǎn)生的根本原因是改善預(yù)后的關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究顯示，腫瘤干細(xì)胞在疾病的發(fā)生、復(fù)發(fā)、以及轉(zhuǎn)移中發(fā)

2、揮著十分重要的作用，腫瘤化療的失敗可能與腫瘤干細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞除有自我更新、高致瘤性和分化潛能外，因其細(xì)胞膜表面高表達(dá)ATP-bindingcassette(ABC)transporters家族膜蛋白，這類蛋白可運輸并外排包括代謝產(chǎn)物、藥物、內(nèi)源性酯類、多肽等多種物質(zhì)，使許多殺傷腫瘤的藥物作用明顯減弱。因此開展對卵巢癌干細(xì)胞的研究對于提高臨床耐藥的卵巢癌患者的5年生存率具有重要意義。
　　 對于特異性表面標(biāo)記物的

3、篩選鑒定是開展腫瘤干細(xì)胞研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。分離腫瘤干細(xì)胞的常規(guī)方法是首先篩選出可能的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記抗原，通過熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescence activated cell sorting,FACS)和磁激活細(xì)胞分選(magneticactivated cell sorting，MACS)等方法分選出具有該標(biāo)記的細(xì)胞，再進(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞活性檢測以及細(xì)胞移植、克隆形成、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分化等檢驗，分析所篩選出的細(xì)胞是否具有

4、腫瘤干細(xì)胞潛能。然而，迄今為止仍未發(fā)現(xiàn)卵巢癌干細(xì)胞存在著明確的特異性表面標(biāo)志物。
　　 本研究旨在尋找可能的卵巢癌干細(xì)胞特異性表面分子標(biāo)志物，并驗證其陽性的細(xì)胞亞群是否具有腫瘤干細(xì)胞潛能。運用SP細(xì)胞分選的方法，從兩株卵巢癌細(xì)胞系中分選出富含干細(xì)胞的SP細(xì)胞亞群，采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記和以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對SP和非SP細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選可能的卵巢癌干細(xì)胞特異性標(biāo)記物的候選蛋白，進(jìn)一步對候選蛋白陽性

5、細(xì)胞進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞特性的驗證。
　　 研究方法：
　　 1、運用Moflo熒光激活細(xì)胞流式分選儀分選出卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3、A2780中SP細(xì)胞亞群，并進(jìn)行細(xì)胞系SP細(xì)胞募集，使得細(xì)胞系中SP細(xì)胞比例穩(wěn)定在5%以上，可體外傳代，可凍存。采用細(xì)胞培養(yǎng)條件下同位素穩(wěn)定標(biāo)記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SLIAC）法分別以輕型、重型賴氨

6、酸對富含干細(xì)胞的A2780、SKOV3細(xì)胞SP細(xì)胞亞群的進(jìn)行穩(wěn)定培養(yǎng)同位素標(biāo)記，流式分選并收集足夠數(shù)量的重型賴氨酸標(biāo)記的SP細(xì)胞及輕型賴氨酸標(biāo)記的NSP細(xì)胞。采用梯度離心法特異性從少量細(xì)胞中分離細(xì)胞膜成分，分別提取SP、NSP細(xì)胞膜蛋白，并將等量的SP細(xì)胞膜蛋白和NSP細(xì)胞膜蛋白充分混合，分離酶解肽段，質(zhì)譜檢測并定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得A2780、SKOV3共表達(dá)差異膜表面蛋白。根據(jù)差異表達(dá)水平及文獻(xiàn)檢索相關(guān)蛋白質(zhì)功能，篩選差異表達(dá)候選

7、膜蛋白，作為后續(xù)研究目標(biāo)蛋白。
　　 2、運用免疫印跡技術(shù)鑒定差異表達(dá)候選蛋白，篩選CDC50A作為卵巢癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志蛋白候選蛋白。細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)的CDC50A在細(xì)胞內(nèi)的定位，同時半定量分析CDC50A在SP和NSP細(xì)胞亞群內(nèi)表達(dá)水平。特異性熒光抗體標(biāo)記卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3和A2780，利用Moflo熒光激活細(xì)胞流式分選儀分選出候選蛋白陽性和陰性細(xì)胞亞群，并體外培養(yǎng)，富集各亞群細(xì)胞。

8、>　　 3、采用流式細(xì)胞儀篩選候選蛋白陽性及陰性細(xì)胞亞群，驗證其在DMEM(HG)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后再次分化成其他亞群的能力；MTT法驗證候選蛋白陽性、陰性細(xì)胞亞群對紫杉醇和順鉑耐藥性差異；同時采用此法測定每種細(xì)胞系候選蛋白陽性、陰性細(xì)胞亞群的細(xì)胞生長曲線：應(yīng)用BD熒光激活流式細(xì)胞分析儀分析SKOV3細(xì)胞系中各亞群細(xì)胞周期，觀察各細(xì)胞周期所占的比例，來檢測其增生活躍情況。收集卵巢上皮癌細(xì)胞系候選蛋白陽性、陰性亞群細(xì)胞，通過單細(xì)胞接種96

9、孔板，培養(yǎng)觀察其單細(xì)胞克隆形成率，比較不同亞群的單細(xì)胞克隆形成能力；等量候選蛋白表達(dá)陽性、陰性細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠皮下，每組三只，觀察成瘤速度，觀察終止點為兩組成瘤率或成瘤大小出現(xiàn)明顯統(tǒng)計學(xué)差異；此外，運用RT-PCR技術(shù)，驗證候選蛋白陽性細(xì)胞中其他幾種主要干細(xì)胞相關(guān)基因(Oct-4、β-catenin、ABCG2)的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、成功分選并募集卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞系SP細(xì)

10、胞，SP細(xì)胞亞群比例穩(wěn)定在6%～15%。成功運用細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)同位素標(biāo)記技術(shù)完成SP和NSP細(xì)胞蛋白賴氨酸標(biāo)記。并有效地從106個細(xì)胞中提取出約12ug細(xì)胞膜蛋白，滿足SLIAC蛋白質(zhì)組學(xué)分析所需蛋白質(zhì)質(zhì)量要求。運用SLIAC技術(shù)分析出A2780 SP、NSP細(xì)胞表達(dá)差異膜蛋白共2730種，其中成功測算表達(dá)差異的有1989種，表達(dá)差異在5.0以上的蛋白存在34種；SKOV3 SP、NSP細(xì)胞表達(dá)差異膜蛋白共分析2674種，成功測算表達(dá)差異

11、的有1561種，其中表達(dá)上調(diào)蛋白920種。以SKOV3細(xì)胞株SP細(xì)胞表面差異表達(dá)膜蛋白為基準(zhǔn)，同時參考A2780細(xì)胞株SP差異表達(dá)蛋白，通過對兩個細(xì)胞系2000多種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較分析，以在兩種細(xì)胞株共同表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞膜蛋白、以及H/L＞5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，最終篩選出2種共表達(dá)差異膜蛋白CD59、CDC50A(又名TMEM30A)作為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物候選蛋白，進(jìn)行后續(xù)研究鑒定。
　　 2、

12、運用特異性熒光抗體標(biāo)記卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3和A2780，細(xì)胞流式分選技術(shù)成功分選出候選蛋白CDC50A和CD59表達(dá)陽性和陰性細(xì)胞亞群，并體外培養(yǎng)，富集各亞群細(xì)胞。CDC50A陽性細(xì)胞經(jīng)過三次分選募集，在卵巢癌細(xì)胞系中比例穩(wěn)定1%以上。CD59陽性細(xì)胞比例第一次分選即為接近100%，理論上不符合干細(xì)胞低比例特性，所以放棄對于CD59作為卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的的進(jìn)一步的研究，后續(xù)單以CDC50A作為卵巢癌干細(xì)胞表面標(biāo)志候選蛋白進(jìn)行深

13、入鑒定及分析。運用免疫印跡技術(shù)證實在卵巢上皮癌細(xì)胞系SP亞群細(xì)胞中CDC50A的表達(dá)水平較NSP細(xì)胞明顯上調(diào)。并通過細(xì)胞免疫熒光激光共聚焦技術(shù)觀察并鑒定CDC50A在細(xì)胞細(xì)胞膜上的定位表達(dá)。
　　 3、腫瘤干細(xì)胞特性的驗證的實驗表明，流式分選出CDC50A+細(xì)胞亞群，體外培養(yǎng)出CDC50A-細(xì)胞，而CDC50A-細(xì)胞未能分化出CDC50A+細(xì)胞，表明CDC50A+細(xì)胞具有多向分化潛能。細(xì)胞生長曲線的結(jié)果顯示，CDC50A+細(xì)胞生

14、長速度明顯快于CDC50A-細(xì)胞。MTT對細(xì)胞耐藥性的檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)CDC50A+、CDC50A-細(xì)胞在對紫杉醇和順鉑耐藥方面存在明顯差異，尤其是對順鉑的耐藥性比較發(fā)現(xiàn)，CDC50A+細(xì)胞對順鉑的耐藥指數(shù)明顯高于CDC50A-細(xì)胞。細(xì)胞增殖周期檢測結(jié)果提示CDC50A+細(xì)胞處于靜止期的比例高于CDC50A-細(xì)胞。體外細(xì)胞克隆形成實驗證實，SKOV3細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞單克隆形成率為12.5%，而CDC50A-細(xì)胞單克隆形成率僅為4

15、.86%，兩者相比差別存在明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0142＜0.05；同樣，A2780細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞的單克隆形成率為18.75%，明顯高于CDC50A-細(xì)胞5.56%的克隆形成率為5.56%，P=0.0075＜0.05，差別具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步驗證了CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯強于CDC50A-細(xì)胞，小量CDC50A+細(xì)胞組在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤率100%，平均成瘤時間20天，而相同數(shù)量CD

16、C50A-細(xì)胞組和SKOV3貼壁細(xì)胞組在觀察結(jié)束時尚未發(fā)現(xiàn)成瘤。檢測Oct-4、β-catenin、ABCG2三種干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，除在A2780細(xì)胞株內(nèi)β-catenin無明顯變化外，兩細(xì)胞株在CDC50A+細(xì)胞亞群中三種干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系內(nèi)存在SP細(xì)胞亞群，比例偏低，經(jīng)過不斷的培養(yǎng)、分選可以達(dá)到SP細(xì)胞的募集，所分選出的卵巢癌細(xì)胞系SP亞群細(xì)胞具有干細(xì)胞

17、特性，成功獲得了后續(xù)干細(xì)胞研究的基本對象。本研究首次采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記和以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)，成功標(biāo)記并分析出SP細(xì)胞內(nèi)表達(dá)極為微量的差異表達(dá)蛋白，成功地運蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從12ug總膜蛋白中高通量的分析并篩選出上千種差異表達(dá)蛋白，并綜合分析從中篩選CDC50A和CD59兩種蛋白質(zhì)作為干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記候選蛋白。
　　 2、體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系內(nèi)CDC50A陽性亞群細(xì)胞比例低于1%，CD59接近10

18、0%，從而確定CDC50A作為候選蛋白繼續(xù)研究。運用免疫印跡技術(shù)證實在卵巢上皮癌細(xì)胞系SP亞群細(xì)胞中CDC50A的表達(dá)水平較NSP細(xì)胞明顯上調(diào)。免疫熒光激光共聚焦技術(shù)觀察鑒定CDC50A在細(xì)胞細(xì)胞膜上的定位表達(dá)。
　　 3、體外和動物實驗的結(jié)果表明，卵巢癌細(xì)胞系內(nèi)CDC50A陽性亞群細(xì)胞具有自我更新、多向分化和無限增殖等潛能。與CDC50A-細(xì)胞相比，Oct-4、β-catenin、ABCG2等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)明顯增高。動物