特異性的HER-2 siRNA對卵巢癌細(xì)胞作用的研究.pdf

1、卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中，60％～90％是上皮性癌，卵巢上皮性癌(卵巢癌)是病死率最高的婦科惡性腫瘤，盡管隨著手術(shù)技巧的提高可以做到最大限度的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，且鉑類、紫杉醇類以及二線化學(xué)藥物治療(化療)的臨床應(yīng)用給患者帶來多重生機(jī)，但是卵巢癌因臨床癥狀隱匿，診斷時超過70％的患者已屬晚期，相當(dāng)一部分患者在手術(shù)和化療后仍會出現(xiàn)疾病進(jìn)展或者復(fù)發(fā)，5年生存率不到30％。表皮生長因子受體-2(HER-2)原癌基因編碼—185kD具有酪氨酸激酶活性的

2、跨膜糖蛋白，在卵巢癌中多伴隨過度表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后及對各種治療的抗性有關(guān)。在人類，HER-2多通過野生型基因的擴(kuò)增和過表達(dá)激活，之后，通過一定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附、轉(zhuǎn)化、存活、凋亡，使得細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞周期加速、惡性表現(xiàn)增強(qiáng)，并出現(xiàn)抗凋亡現(xiàn)象。若能把HER-2的信號功能敲除就能消弱和減少惡性細(xì)胞的生長。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的，由與靶基因序列同源的雙鏈RN

3、A(double-strandedRNA，dsRNA)介導(dǎo)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。RNAi實(shí)驗(yàn)時，靶位點(diǎn)的設(shè)計是RNAi成功的關(guān)鍵。目前，RNAi的實(shí)施方法有五種，化學(xué)合成21-23bp的小干擾RNA(smallintefferingRNA，siRNA)雖然能有效降低靶基因的表達(dá)，但合成費(fèi)用昂貴而限制了其廣泛應(yīng)用；載體介導(dǎo)的RNAi適合特異性靶位點(diǎn)選出后的研究，用于靶位點(diǎn)的篩選比較繁瑣；雞尾酒法和siRNA

4、表達(dá)框這兩種方法也不適合基因靶位點(diǎn)的篩選。因此我們采用T7RNA體外轉(zhuǎn)錄以獲取siRNA。第一部分：癌基因HER-2RNAi的靶位點(diǎn)的篩選及鑒定；第二部分：觀察抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞HER-2的表達(dá)后，其對卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3生物學(xué)特性的影響；第三部分：觀察其對卵巢癌順鉑敏感性的影響，為卵巢癌基因治療提供一定的理論依據(jù)，為卵巢癌的化療耐藥提供新策略。 實(shí)驗(yàn)材料及方法： 第一部分：首先選用已知的干擾GAPD

5、H的特異性靶位點(diǎn)作為陽性對照，采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞，采用WesternBlot的方法檢測GAPDH蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證體外轉(zhuǎn)錄體系的可行性。然后在HER-2基因的編碼區(qū)內(nèi)根據(jù)靶位點(diǎn)的設(shè)計原則，選擇三段靶序列，體外轉(zhuǎn)錄合成HER-2siRNA，轉(zhuǎn)染人SKOV-3細(xì)胞，用Real-timePCR和Westernblot鑒定三個靶位點(diǎn)對HER-2基因mRNA和蛋白的干擾效果。 第二部分：采用MTF檢測細(xì)胞增殖能力的改變；A

6、nnexin-V檢測細(xì)胞凋亡率的變化，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；Transwell和細(xì)胞趨化運(yùn)動實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外侵襲和趨化運(yùn)動能力的改變；WesternBlot檢測參與HER-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子如c-fos、c-jun、NF-κB等蛋白的表達(dá)。 第三部分：采用MTT和Annexin-V的方法檢測順鉑聯(lián)合特異性HER-2siRNA對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響；Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)

7、果： 第一部分：WesternBlot結(jié)果顯示GAPDHsiRNA能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)源性GAPDH蛋白的表達(dá)，并隨著siRNA劑量的增加，GAPDH蛋白的表達(dá)逐漸降低。這說明我們建立的體外轉(zhuǎn)錄體系是可行的，然后我們又進(jìn)一步優(yōu)化了此體系的各項實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了完善的T7體外轉(zhuǎn)錄體系。結(jié)果顯示其中siRNAⅢ可顯著降低HER-2基因表達(dá)。我們把這個特異性的siRNAⅢ轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低HER-2mRNA的表達(dá)，并呈時間及

8、劑量依賴性。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HER-2siRNAⅢ轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞作為特異性干涉組。 第二部分：(1)RNA干涉HER-2后，能顯著抑制細(xì)胞增殖，特異性干涉組細(xì)胞的增殖速率明顯低于非特異性干涉組及空白對照組(P＜0.05)。(2)采用流式細(xì)胞儀檢測干涉HER-2后SKOV-3凋亡情況。發(fā)現(xiàn)隨著HER-2mRNA表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加，干涉后第6天凋亡率最高，達(dá)(53.16±0.963)％，空白對照組為(4.07±0.315)％，而

9、隨著HER-2表達(dá)恢復(fù)，凋亡率下降至干涉前水平。特異性干涉組與非特異性干涉組、空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，非特異性干涉組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(3)TUNEL結(jié)果顯示特異性干涉組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，胞核濃聚致密的斑點(diǎn)狀，大小不一，形成凋亡小體，進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了凋亡的產(chǎn)生。特異性干涉組細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于非特異性干涉組及空白對照組(P＜0.001)。(4)HER-2siRNA抑

10、制卵巢癌HER-2表達(dá)后，下調(diào)c-fos，c-jun及NF-κB基因，上調(diào)P53基因，對HER-2參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起到了調(diào)節(jié)作用。(5)HER-2siRNA抑制卵巢癌HER-2表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲和趨化運(yùn)動能力顯著減弱。 第三部分：(1)MTT分析結(jié)果顯示，三組細(xì)胞在暴露于順鉑24h后，各組細(xì)胞的存活率均隨順鉑濃度的增加而降低，但降低的幅度不同，其中，轉(zhuǎn)染HER-2siRNA組細(xì)胞的存活率降低最為顯著。在給予1μg/mL順鉑后，

11、轉(zhuǎn)染HER-2siRNA組細(xì)胞存活率(58.13±4.67)％與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(65.28±5.73)％、空白對照組(68.46±2.83)％相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，而非特異性組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(2)HER-2siRNA聯(lián)合順鉑后細(xì)胞的凋亡率明顯增加，與單獨(dú)使用順鉑及單獨(dú)使用HER-2siRNA組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。在HER-2siRNA聯(lián)合順鉑組中抗凋

12、亡蛋白Bcl-2、Survivin、XIAP明顯低于順鉑組；促進(jìn)凋亡的蛋白Smac明顯高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 第一部分：(1)建立RNAi體外轉(zhuǎn)錄體系，選用干擾GAPDH特異性靶位點(diǎn)，并在卵巢癌細(xì)胞中驗(yàn)證此體系可行，優(yōu)化和完善了各項實(shí)驗(yàn)參數(shù)。應(yīng)用此系統(tǒng)，使對靶基因RNAi特異性靶位點(diǎn)的篩選變得簡單易行。(2)應(yīng)用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對卵巢癌癌基因HER-2特異性靶位點(diǎn)進(jìn)行篩選，得到一個可使HE

13、R-2基因表達(dá)下降70％以上的特異性靶位點(diǎn)，這使我們對癌基因HER-2的反向遺傳研究提供了前提基礎(chǔ)。 第二部分：1.HER-2siRNA能顯著抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與c-fos、c-jun、P53及NF-κB參與細(xì)胞增殖和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 2.HER-2siRNA能顯著抑制細(xì)胞侵襲和趨化運(yùn)動能力。 第三部分：1.HER-2siRNA能增加卵巢癌SKOV-3細(xì)胞對順鉑的敏感性，顯著誘導(dǎo)凋亡。HER-2