基于SP細(xì)胞分選法初步研究卵巢癌干細(xì)胞.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中列居第三，但其致死率卻為各類婦科腫瘤之首。當(dāng)前，卵巢癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療、物理治療等，這些方法的基本思路是把腫瘤看作是一個(gè)均質(zhì)性整體，以減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，最大限度清除腫瘤病灶為目的。但是部分腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療的抵抗從而造成腫瘤的復(fù)發(fā)是腫瘤治療的主要障礙。因此，探索卵巢癌發(fā)病機(jī)制，尋找其治療的新途徑，已成為進(jìn)一步提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵。 隨著干細(xì)

2、胞（Stem Cells，SC）研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一種干細(xì)胞疾病。研究顯示，腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細(xì)胞（Tumor Stem Cell，TSC）或癌干細(xì)胞（Cancer Stem Cell，CSC），具有無限增生的潛能，對(duì)化療、放療具有抗性，在腫瘤中充當(dāng)干細(xì)胞的角色，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的決定性因素。以往對(duì)卵巢癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的研究忽視了CSC的存在及其重要性。由于CSC的存在，現(xiàn)有治療方法不能有效抑制卵巢

3、癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)。目前，從形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分CSC與腫瘤細(xì)胞間的差異，只能用功能學(xué)方法即對(duì)其自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC?，F(xiàn)分離CSC的方法主要有三種：側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞分選法、無血清培養(yǎng)富集干細(xì)胞及通過CSC表面特異性標(biāo)志篩選。其中SP細(xì)胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外，表現(xiàn)弱熒光信號(hào)的細(xì)胞群，占總體細(xì)胞的很少部分。多項(xiàng)研究表明，部分腫瘤（乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等）中

4、SP細(xì)胞具有CSC特性，表現(xiàn)為：表達(dá)SC相關(guān)表面標(biāo)志、具有自我更新能力、強(qiáng)致瘤能力、高表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2等。因此，我們利用SP細(xì)胞與SC、CSC具有許多共性的特點(diǎn)來富集分離CSC。在缺乏顯著的CSC分子標(biāo)記的情況下，SP細(xì)胞的篩選分析，可以作為CSC鑒定的一種實(shí)用而簡易的重要方法之一。 本研究選擇人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780為研究對(duì)象，對(duì)其內(nèi)的SP和Non-SP細(xì)胞作細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，判斷SP細(xì)胞分選法能否作為分離卵巢CSC的

5、一種有效方法。隨后在SP細(xì)胞研究的基礎(chǔ)上探討ABCG2分子能否作為卵巢CSC表面特異性標(biāo)志。 目的： 基于SP細(xì)胞分選法，鑒定A2780細(xì)胞株中SP細(xì)胞是否具有CSC特性，判斷SP細(xì)胞分選法能否作為分離卵巢CSC的一種有效方法。在SP細(xì)胞研究的基礎(chǔ)上，探討ABCG2分子陽性細(xì)胞的生物學(xué)特性，判斷ABCG2分子是否為卵巢CSC表面特異性分子標(biāo)志。最后模擬體內(nèi)環(huán)境對(duì)鑒定的具有耐藥性的細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出敏感的化療藥物，為

6、臨床靶向治療卵巢癌提供一定的指導(dǎo)。 方法： 1．基于FACS分選技術(shù)檢測(cè)并分選A2780細(xì)胞株中SP和Non-SP細(xì)胞。 2．SP和Non-SP細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特性研究。分別從細(xì)胞增殖活性、體外克隆形成能力、裸鼠體內(nèi)致瘤性、對(duì)化療藥物的耐受性及ABCG2分子表達(dá)水平這幾方面綜合鑒定卵巢癌中SP細(xì)胞與CSC的相關(guān)性。 3．免疫磁選技術(shù)分離獲取ABCG2分子陽性和陰性表型細(xì)胞。 4．ABCG2分子陽

7、性和陰性細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特性研究。分別從細(xì)胞增殖活性、體外克隆形成能力、體內(nèi)致瘤性、SP細(xì)胞表達(dá)情況、對(duì)化療藥物的耐受性及利用單抗封閉后陽性細(xì)胞的耐受性等方面綜合分析ABCG2分子在卵巢CSC中的作用。 5．在模擬體內(nèi)環(huán)境的三維培養(yǎng)基中對(duì)ABCG2分子陽性和陰性的細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)卵巢癌中ABCG2分子陽性細(xì)胞敏感的化療藥物。 結(jié)果： 1．FACS分選技術(shù)檢測(cè)出A2780細(xì)胞株中SP細(xì)胞比例約為2．6％

8、，將FACS圖中門區(qū)域的細(xì)胞分選下來，從1×107細(xì)胞中可得到約2×105個(gè)SP細(xì)胞。 2．對(duì)SP和Non-SP細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特性研究，結(jié)果顯示：SP細(xì)胞在普通培養(yǎng)基上細(xì)胞增殖活力、在平板和軟瓊脂內(nèi)的克隆形成能力均顯著高于Non-SP細(xì)胞；SP細(xì)胞在Balb/c裸鼠體內(nèi)的致瘤能力、對(duì)化療藥物長春新堿的耐受性均顯著高于Non-SP細(xì)胞；SP細(xì)胞中ABCG2分子的表達(dá)量也顯著高于Non-SP細(xì)胞。 3．利用免疫磁選技

9、術(shù)分離獲取A2780細(xì)胞中ABCG2分子陽性表型細(xì)胞，1×107的A2780細(xì)胞可得到約2×105的ABCG2分子陽性細(xì)胞，即A2780細(xì)胞中ABCG2分子陽性表型細(xì)胞約占2％左右，其含量與SP細(xì)胞的比例相似。 4．對(duì)ABCG2分子陽性和陰性表型細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特性研究，結(jié)果顯示：ABCG2分子陽性細(xì)胞普通培養(yǎng)基上的細(xì)胞增殖活力、在體外克隆形成能力、體內(nèi)致瘤能力僅略高于ABCG2分子陰性細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ABCG2

10、分子陽性細(xì)胞中SP細(xì)胞含量明顯高于Non-SP細(xì)胞；ABCG2分子陽性細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性明顯高于ABCG2分子陰性細(xì)胞，用ABCG2分子的單克隆抗體封閉ABCG2分子陽性細(xì)胞后其細(xì)胞耐受性明顯降低。 5．在三維培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)ABCG2分子陽性細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性明顯高于順鉑及阿霉素。紫杉醇較低劑量時(shí)就可明顯抑制ABCG2分子陽性細(xì)胞的增殖。 結(jié)論： 1．A2780細(xì)胞株中SP細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性基本符合CSC。