樹(shù)突狀細(xì)胞影響CIK細(xì)胞體內(nèi)外特異性殺傷卵巢癌細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分目的:1、臍帶血CD34<'+>干細(xì)胞及單核細(xì)胞來(lái)源DC的數(shù)量、免疫表型及功能比較;2、負(fù)載卵巢癌細(xì)胞系總RNA抗原DC對(duì)CIK細(xì)胞在體外特異性殺傷的影響.方法:1、利用免疫磁珠法純化臍帶血CD34<'+>干細(xì)胞,貼壁法純化臍帶血單核細(xì)胞;2、分別在干細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入SCF、FL、GM-CSF、IL-4及TNF-α,單核細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入GM-CSF、IL-4及TNF-α以誘導(dǎo)成熟DC;3、計(jì)算干細(xì)胞組擴(kuò)增DC的數(shù)量;4、利用

2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的免疫表型,觀察兩組來(lái)源不同DC的特異標(biāo)志、表面黏附分子及HLA分子的表達(dá)有無(wú)差異,以混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)兩組來(lái)源不同DC在功能上有無(wú)差異;5、Trizol提取卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及H08910的總RNA作為腫瘤抗原,轉(zhuǎn)染臍帶血CD34<'+>干細(xì)胞來(lái)源的DC;6、在臍帶血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入T-INF、IL-1β、OKT-3及IL-2,誘導(dǎo)CIK細(xì)胞,計(jì)算擴(kuò)增并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型;7、效應(yīng)細(xì)胞分為與轉(zhuǎn)染

3、SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、與轉(zhuǎn)染H08910 DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、與未轉(zhuǎn)染DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、單純CIK細(xì)胞組;靶細(xì)胞分為SKOV3及H08910卵巢癌細(xì)胞系,分別在效靶比為100:1及50:1的條件下以LDH釋放法檢測(cè)CIK細(xì)胞的體外殺傷活性.小結(jié):1、臍帶血單個(gè)核細(xì)胞可以擴(kuò)增出大量的CIK細(xì)胞,是一種高效的卵巢癌免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞;2、臍帶血CD34<'+>干細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因子作用下可擴(kuò)增誘導(dǎo)出大量成熟有功能的

4、DC,適合作為DC的前體細(xì)胞.而以Trizol提取腫瘤細(xì)胞總RNA簡(jiǎn)便易行,可用于沖擊DC,進(jìn)而致敏CIK細(xì)胞,誘導(dǎo)出CIK細(xì)胞更強(qiáng)大的特異性腫瘤殺傷作用.第二部分目的:1、建立誘導(dǎo)卵巢癌患者腹水來(lái)源的DC方法,并與傳統(tǒng)外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC做數(shù)量、免疫表型及功能的比較;2、觀察卵巢癌患者腹水來(lái)源的DC對(duì)CIK在體外及SCID小鼠體內(nèi)殺傷卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的影響.方法:1、利用梯度密度離心法及貼壁法純化卵巢癌患者腹水及外周血中的單核

5、細(xì)胞;2、在培養(yǎng)體系內(nèi)加入GM-CSF、IL-4及TNF-α以誘導(dǎo)成熟DC;3、流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)DC的免疫表型,觀察兩組來(lái)源不同DC的特異標(biāo)志、表面黏附分子及HLA分子的表達(dá)有無(wú)差異,以混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)比較兩組來(lái)源不同DC的功能;4、反復(fù)凍融獲得卵巢癌細(xì)胞系SKOV3全細(xì)胞抗原作為腫瘤抗原,沖擊腹水單核細(xì)胞來(lái)源的DC;5、在外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入T-INF、IL-1β、OKT-3、PHA-P及IL-2,誘導(dǎo)CIK細(xì)胞,計(jì)算擴(kuò)增

6、并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型;6、效應(yīng)細(xì)胞分為與SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、與H08910 DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、與空白DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、單純CIK細(xì)胞組;靶細(xì)胞為SKOV3卵巢癌細(xì)胞系,分別在效靶比為50:1及25:1的條件下以LDH釋放法檢測(cè)CIK細(xì)胞的體外殺傷活性;7、SCID小鼠腹腔內(nèi)接種SKOV3細(xì)胞系1天后分別腹腔注射與SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細(xì)胞組、單純CIK細(xì)胞組治療及對(duì)照組,3周后處死,按評(píng)分表評(píng)定