農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米大斑病菌的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、玉米大斑病菌(無性態(tài)Exserohilum turcicum，有性態(tài)Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上一種重要的真菌病害，在世界主要玉米產(chǎn)區(qū)都曾造成過嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，致病相關(guān)基因功能研究的最直接的方法是通過創(chuàng)建該基因的缺失突變體，進(jìn)一步觀察突變體表型上的變化，進(jìn)而推測該基因的功能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)(agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATM

2、T)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以其特有的優(yōu)點(diǎn)成為研究真菌與其寄主互作的有力工具。 本研究利用ATMT技術(shù)，創(chuàng)建了玉米大斑病菌突變體，并對(duì)部分突變體進(jìn)行了分析，具體結(jié)果如下： (1)本文對(duì)玉米大斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵條件、因素和參數(shù)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，確定了最適篩選轉(zhuǎn)化子的潮霉素濃度為50μg/mL，頭孢噻肟鈉與羧卞青霉素對(duì)農(nóng)桿菌有效抑制的濃度為200/200μg/mL。確定了共培養(yǎng)最佳方式是將萌發(fā)的玉米大斑病菌分生孢子與農(nóng)桿菌混合物2

3、5℃共培養(yǎng)于Fries培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)的最佳時(shí)間為2d，從接種病斑上分離并萌發(fā)的分生孢子作為轉(zhuǎn)化受體其轉(zhuǎn)化效率最高。應(yīng)用最適的轉(zhuǎn)化條件，試驗(yàn)最終平均從10<'5>個(gè)分生孢子中可獲得40～60個(gè)玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化子。 (2)試驗(yàn)對(duì)所獲得的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR及Southern blot驗(yàn)證。根據(jù)T-DNA上已知潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測的轉(zhuǎn)化子均含有目的潮霉素基因片段。隨機(jī)選取其中4個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southe