B型鈉尿肽抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制及其與TGF-β、鈉尿肽受體的關(guān)系.pdf

1、目的：探討B(tài)型鈉尿肽(Brain/B-type natriuretic peptide，BNP)抑制心臟成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts，CFs)增殖機(jī)制及其與TGF-β、鈉尿肽受體(natriureticpeptide receptors，NPRs)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。 方法：采用胰酶消化法和差速貼壁法提取原代乳鼠心臟成纖維細(xì)胞并純化，以形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定：原代CFs經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)24h

2、同步化處理后，采用重組心肌營(yíng)養(yǎng)素(Cardiotrophin-1，CT-1)刺激細(xì)胞，加入不同濃度BNP(5×10-4mol/L、5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L、5×10-9mol/L)進(jìn)行Brdu增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；以CFs為對(duì)象，同步化處理后，加入BNP、TGF-β1的I型受體特異性抑制劑SB-431542、鈉尿肽受體A(natriureticpeptide receptor

3、-A，NPR-A)抑制劑CANF4-23、BNP+SB-431542和BNP+CANF4-23干預(yù)，放射免疫檢測(cè)cGMP；以CFs為對(duì)象，同步化處理后，用CT-1刺激增殖24h，分別加入BNP和SB-431542，分為BNP組、SB-431542組和BNP+SB-431542組，干預(yù)后收集培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1濃度。收集細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BNP組、SB-431542組和BNP+SB-4

4、31542組smad4 mRNA變化。 結(jié)果： 1.采用胰酶消化法和差速貼壁法原代提取純化的CFs存活率高，純度好。 2.不同濃度的BNP對(duì)CT-1刺激細(xì)胞增殖的抑制程度不同，隨著BNP濃度減小，抑制CT-1刺激心肌成纖維細(xì)胞的增殖作用減弱，存在明顯的劑量依賴效應(yīng)，但兩者并非簡(jiǎn)單的反比關(guān)系，在5×10-6～5×10-7mol/L時(shí)變化最顯著。 3.各實(shí)驗(yàn)組在加藥后CFs胞內(nèi)cGMP水平變化不一，BNP組和

5、BNP+SB-431542組胞內(nèi)cGMP水平分別為6.16±1.30 pmol/ml和6.01±1.17pmol/ml，與對(duì)照組相4.57±1.25pmol/ml相比明顯升高(P<0.05，n=6)，BNP組和BNP+SB-431542組之間沒有顯著區(qū)別。其他各藥物組與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05，n=6)。 4.BNP組、SB-431542組、BNP+SB-431542組三組TGFβ1濃度與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.

6、05)，但不同藥物組之間沒有顯著差異(P>0.05)。BNP組、SB-431542組、BNP+SB-431542組三組較正常組smad4 mRNA水平明顯下降(P<0.05)，并且BNP+SB-431542組smad4 mRNA表達(dá)水平顯著低于BNP組和SB-431542組(P<0.01)，而后兩者smad4 mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.BNP抑制CT-1刺激增殖的CFs有劑量依賴性，但非普通的