己酮可可堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、TGF-βI及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、瘢痕疙瘩是皮膚組織對(duì)創(chuàng)傷和/或炎癥反應(yīng)所致的良性纖維組織的異常增生,常超出原創(chuàng)傷范圍向周邊的正常組織進(jìn)行性侵入生長(zhǎng)。特征是大量的成纖維細(xì)胞增生和過度的膠原沉積,嚴(yán)重者可影響美觀并導(dǎo)致局部功能障礙,目前多采用聯(lián)合治療的方法,但療效欠佳且有復(fù)發(fā)的可能。故對(duì)瘢痕疙瘩的形成機(jī)制和防治的研究一直是皮膚外科領(lǐng)域一個(gè)非常重要的課題。成纖維細(xì)胞可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)且性狀穩(wěn)定是研究瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制和篩選有效藥物的良好模型。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)己酮可可堿具有廣泛的

2、抗纖維化作用,而對(duì)瘢痕疙瘩的基礎(chǔ)研究卻少有報(bào)道,故本研究以己酮可可堿干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞,研究在不同濃度己酮可可堿作用下成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達(dá)的變化,通過本研究,初步探討瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制,為進(jìn)一步將己酮可可堿應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和更準(zhǔn)確的使用方法。
　　 第一部分、人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
　　 目的：學(xué)習(xí)和比較人瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞的原代

3、培養(yǎng)技術(shù),為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 方法：利用組織塊貼壁法分別培養(yǎng)人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞,以細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定兩種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)、傳代、純化了人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的數(shù)量倍增時(shí)間為46.4小時(shí),正常皮膚成纖維細(xì)胞的數(shù)量倍增時(shí)間為54.8小時(shí),兩者的增殖速度有明顯差異。
　　 結(jié)論：觀察和比較了人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的全過程,獲得了大

4、量純化的人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞,并為進(jìn)一步的細(xì)胞內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了物質(zhì)基礎(chǔ)；瘢痕疙瘩組成纖維細(xì)胞的數(shù)量倍增時(shí)間較正常對(duì)照組明顯縮短,顯示其快速增殖的特點(diǎn)。
　　 第二部分、己酮可可堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)的影響
　　 目的：研究不同濃度己酮可可堿對(duì)體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞增殖、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)的影響,初步探討己酮可可堿防治瘢痕疙瘩的

5、作用機(jī)理,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和更準(zhǔn)確的使用方法。
　　 方法：取5～8代人瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞為模型,加入不同濃度的己酮可可堿,利用MTT比色法檢測(cè)其對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性的影響；用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定各個(gè)時(shí)段各孔上清液中TGF-β1的含量；采用RT-PCR方法檢測(cè)其對(duì)瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞在Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)上的差別。
　　 結(jié)果：(1)己酮可可堿能明顯抑制瘢痕疙瘩及正常皮膚

6、成纖維細(xì)胞的增殖,濃度在0.1～2mg/ml范圍內(nèi)呈明顯的量效-時(shí)效關(guān)系。當(dāng)濃度2 mg/ml時(shí)其抑制率達(dá)到最高水平。但比較正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組間抑制率差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。(2)與對(duì)照組相比,己酮可可堿0.25mg/ml作用96小時(shí),己酮可可堿0.5、1.0和2.0mg/ml作用24、72、96小時(shí)后,正常皮膚成纖維細(xì)胞在TGF-β1的表達(dá)上差異顯著(P<0.01)。與對(duì)照組相比己酮可可堿0.25、0.5、1.0和

7、2.0(mg/ml)作用24、72、96小時(shí)后,瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在TGF-β1的表達(dá)上差異顯著(P<0.01)。多因素方差分析顯示不同濃度、不同細(xì)胞來(lái)源差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)己酮可可堿作用前,瘢痕疙瘩組Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)均較正常皮膚組有明顯增加,差異顯著(P<0.05)；己酮可可堿作用后,能抑制正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá),隨著濃度的增加,這種抑制作用更加明顯,濃度2mg/ml時(shí)抑制