RNA干擾沉默STAT3基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：肺纖維化(Pulmonary Fibrosis，PF)是初期表現(xiàn)為肺泡炎癥，隨后炎癥、細(xì)胞因子和生長因子等多種因素導(dǎo)致肺組織的異常修復(fù)，表現(xiàn)為肺間質(zhì)細(xì)胞增殖，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)在肺泡腔內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)不可逆重構(gòu)的疾病。成纖維細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)B)向肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MB)轉(zhuǎn)化是PF的發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MB特征性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-

2、Smooth Muscle Actin，α-SMA)，是合成膠原和ECM的主要細(xì)胞并與ECM的沉積有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)可以誘導(dǎo)FB向MB轉(zhuǎn)化，是關(guān)鍵的致纖維化因子。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3，STAT3)是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它可被多種細(xì)胞因子和生長因

3、子激活，活化的STAT3進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)機(jī)體生理和病理過程。STAT3在肺纖維化中的作用尚未闡明。
　　 目的：構(gòu)建表達(dá)RNA干擾片段的質(zhì)粒沉默STAT3基因表達(dá)并研究沉默STAT3基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的FB向MB轉(zhuǎn)化的影響及作用機(jī)制，為PF新藥的開發(fā)和臨床治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：合成針對(duì)STAT3mRNA的2條短發(fā)夾DNA和一條作為陰性對(duì)照的STAT3mRNA非同源序列DNA，分別插入pSi

4、lencerTM4.1-CMVneo質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)RNA干擾片段的重組質(zhì)粒S1RNA-ST3-1，2，N。HFL-Ⅰ細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，所有實(shí)驗(yàn)均采用5-7代細(xì)胞。5μg·L-1TGF-β1刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h后，RT-PCR法檢測(cè)Collagen-Ⅲ、STAT1、PIAS1、STAT3和PIAS3mRNA表達(dá)，刺激0d、1d、3d、5d后，WesternBlot法檢測(cè)STAT1、STAT3和pSTAT3蛋白表

5、達(dá)。SiRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療分為6組，正常對(duì)照組組(BC)；5μg·L-1TGFβ1組(T)；轉(zhuǎn)染試劑組(NC)；SiRNA-ST3-N質(zhì)粒組(SN)；5μg·L-1TGF-β1+SiRNA-ST3-1質(zhì)粒組(S1+T)；5μg·L-1TGF-β1+SiRNA-ST3-2質(zhì)粒組(S2+T)。TGF-β1與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒同時(shí)加入。24h和48h后，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、STAT1、

6、PIAS1、STAT3、PIAS3mRNA表達(dá)，Westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen-Ⅰ、STAT1、STAT3和pSTAT3蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.重構(gòu)質(zhì)粒SiRNA-ST3-1，2，N測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)相符，SiRNA-ST3-1，2轉(zhuǎn)染TGF-β1誘導(dǎo)HFL-I后能有效抑制STAT3mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 2.HFL-Ⅰ細(xì)胞經(jīng)5μg·L-1TGF-β1誘導(dǎo)后，Col

7、lagen-Ⅲ和STAT3表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)，STAT1、PIAS1和PIAS3的表達(dá)則明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　 3.用沉默STAT3基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染5μg·L-1TGF-β1諉導(dǎo)HFL-Ⅰ細(xì)胞，α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和STAT3mRNA的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，STAT1、PIAS1和PIAS3mRNA的表達(dá)則明顯上升(P<0.05)。
　　 4.用沉默STAT3

8、基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染5μg·L-1TGF-β1誘導(dǎo)HFL-Ⅰ細(xì)胞，α-SMA、Collagen-Ⅰ、STAT3和pSTAT3蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，STAT1蛋白表達(dá)則明顯上升(P<0.05)。
　　 結(jié)論：STAT1、PIAS1、STAT3和PIAS3參與TGF-β1誘導(dǎo)FB向MB轉(zhuǎn)化的調(diào)控。阻斷STAT3基因表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)FB向MB轉(zhuǎn)化，其機(jī)制與降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表達(dá)和減少STA