培養(yǎng)胚胎、小兒皮膚成纖維細(xì)胞的比較及TGF-β1對(duì)小兒成纖維細(xì)胞的干預(yù)研究.pdf

1、目的:研究培養(yǎng)人胚胎、小兒皮膚成纖維細(xì)胞及TGF-β1干預(yù)后小兒皮膚成纖維細(xì)胞的盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR-1;discoidin domain receptor)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13;matrix Metalloproteinases)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA;Proliferating cell nuclear antigen)、Ⅰ型膠原(collagenⅠ;Col-Ⅰ)及Ⅲ型膠原(collagenⅢ;Col-Ⅲ)的表

2、達(dá)及相互關(guān)系,從而探討Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解途徑并觀察培養(yǎng)胚胎與小兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征。
　　方法:1.原代培養(yǎng)小兒包皮成纖維細(xì)胞(human postnatal dermal fibroblast;hPDF)和人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞(human fetal dermal fibroblast;hFDF)并傳代;2.應(yīng)用HE染色法觀察hFDF與hPDF的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn);3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)hFDF與hPDF的DDR-1、MM

3、P-13、PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)、Ⅰ型膠原(collagenⅠ;Col-Ⅰ)及Ⅲ型膠原(collagenⅢ;Col-Ⅲ)的表達(dá);4.利用外源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)(5ng/ml)干預(yù)hPDF,并設(shè)立TGF-β1未干預(yù)的對(duì)照組,分別于TGF-β1孵育8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)收獲細(xì)胞;5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法觀察不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1干預(yù)組與對(duì)照組hPDF

4、的PCNA和DDR-1、MMP-13、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的表達(dá);6.應(yīng)用IX-71顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS)在低倍(×100)視野下觀察分析及照相,用Image-pro6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)的平均光密度值;7.所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(c±s)表示。采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析、單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析及多重線性回歸分析法,P<0.05為

5、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.hFDF組DDR-1、MMP-13、Ⅰ、Ⅲ型膠原的平均光密度值皆高于hPDF組(P<0.05),hFDF組與hPDF組的Ⅲ/Ⅰ膠原及PCNA的平均光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.hPDFⅠ型膠原對(duì)DDR-1、Ⅲ型膠原、MMP-13的線性回歸方程顯著成立Y=0.025-0.853x1+0.408x2+0.772x3(x1:DDR-1;x2:Ⅲ型膠原;x3:MMP-13),其余各線性回歸方

6、程皆不成立。3.TGF-β1干預(yù)與對(duì)照組的兩組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)上 I型膠原、Ⅲ型膠原、DDR-1、MMP-13的平均光密度值不同(P<0.05),其中I型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13表達(dá)的基線上調(diào)(P<0.05)。4.DDR-1對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原:Y=0.016+0.238x1-0.100x2(x1:Ⅰ型膠原;x2:Ⅲ型膠原);Ⅰ型膠原對(duì)DDR-1、Ⅲ型膠原:Y=0.002+0.338x1+1.084x2(x1:Ⅲ型膠原;x2:DDR-1)

7、;Ⅲ型膠原對(duì)Ⅰ型膠原、DDR-1、MMP-13:Y=0.016-0.269x1-0.015x2+0.914x3 MMP-13)三條線性回歸方程顯著成立。
　　結(jié)論:1.hFDF比hPDF功能活躍。2.膠原—成纖維細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)中,膠原產(chǎn)生→激活膠原受體 DDR-1→激活基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13途徑在小兒膠原降解中發(fā)揮了作用,但在胚胎膠原降解中未發(fā)揮作用。3.在hPDF中,TGF-β1可以刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原、MMP-13的合成。4.