肝癌干細胞樣細胞的分離及其耐藥性受Akt通路調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景和目的：
　　肝癌在全球腫瘤發(fā)病率位于第五位，占腫瘤致死原因的第三位。目前肝癌的治療以手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療方法為主，但治療效果不理想。近些年來，腫瘤干細胞理論的提出為腫瘤的研究、治療提供了新的思路。越來越多的證據(jù)表明腫瘤組織是由不同的異質(zhì)細胞構(gòu)成，導致腫瘤發(fā)生和維持腫瘤生長的是腫瘤細胞中的極少一部分細胞，這些細胞即為“腫瘤干細胞”。這些細胞具有腫瘤干細胞特性:自我更新、分化及體內(nèi)高致瘤等能力。腫瘤干細胞學說認為腫瘤干

2、細胞是腫瘤組織形成、復發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因，也是腫瘤放療、化療失敗的原因，故對腫瘤的治療應針對腫瘤干細胞以達到根除腫瘤的目的。本研究旨在采用無血清懸浮球培養(yǎng)法從人肝細胞性肝癌細胞株中分離肝癌干細胞樣細胞，初步探討Akt通路調(diào)節(jié)其對化療藥物阿霉素的敏感性。
　　方法：
　　1.將人肝癌細胞株P(guān)LC、HepG2、Hep3B置于無血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成細胞球，選用PLC細胞株進行后續(xù)實驗。
　　2.采用流式細胞術(shù)、克隆形成實驗

3、、誘導分化實驗、SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗鑒定PLC細胞球（肝癌干細胞樣細胞）的腫瘤干細胞特性。
　　3.MTT法、流式細胞儀測定PLC細胞球?qū)熕幬锇⒚顾氐拿舾行浴?br>　　4.流式細胞術(shù)分析加入PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002、阿霉素共同孵育細胞球后，其凋亡率的變化。
　　5.Western blot法比較PLC細胞球、PLC貼壁細胞中P-AKT1S473蛋白分子表達量及加入抑制劑LY294002作用于

4、細胞球后，P-AKT1S473、AKT1蛋白分子表達量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.三株人肝細胞性肝癌細胞株在無血清條件培養(yǎng)基中均可以形成三維、立體的細胞球。
　　2.肝癌干細胞標志物CD90在細胞球中的表達較貼壁細胞顯著升高(P＜0.01)。
　　3.PLC細胞球經(jīng)含血清培養(yǎng)基誘導分化后，可形成梭形、拉伸的非肝細胞樣細胞。
　　4.細胞球的克隆形成數(shù)目（123.00±28.48）為貼壁細胞(56.33±7

5、.37)的2.18倍(P＜0.05)。
　　5.同樣細胞數(shù)接種于SCID小鼠皮下7周后，細胞球的致瘤率明顯大于貼壁細胞。
　　6.以5μg/ml的阿霉素分別處理細胞球和貼壁細胞48h后，細胞球的增殖率（71.83±12.3）％明顯高于貼壁細胞[(45.68±5.95)％(P＜0.05)]，凋亡率（11.73±3.77）％顯著低于貼壁細胞[（41.22±6.73）％(P＜0.01)]，而以阿霉素5μg/ml和LY294002共

6、同孵育細胞球后，其凋亡率(35.44±6.65)％顯著增加(P＜0.01)。
　　7.Western blot檢測到細胞球的P-AKT1S473蛋白分子表達量顯著高于貼壁細胞(P＜0.01)，加入抑制劑LY294002處理細胞球后，P-AKT1S473蛋白表達量明顯降低(P＜0.05)，AKT1的表達量無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　無血清懸浮球培養(yǎng)法可以從人肝癌細胞株中有效富集肝癌干細胞樣細胞（細胞球），肝癌干細胞樣細