骨肉瘤干細(xì)胞及其多藥耐藥性的體內(nèi)外相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨肉瘤是人類最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，有較高的致死和致殘率。目前對于骨肉瘤的治療一般采取化療聯(lián)合手術(shù)切除的綜合療法，但是隨著治療時間的增加，多藥耐藥骨肉瘤細(xì)胞的出現(xiàn)極大的影響了新輔助化療的效果，使骨肉瘤患者的5年生存率徘徊在58％-70％左右，很難再進(jìn)一步提高，成為骨肉瘤治療過程中的主要的障礙和難題。所以研究骨肉瘤多藥耐藥的發(fā)生機制，尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的方法成為目前骨肉瘤治療過程中

2、急需解決的問題。
　　 研究骨肉瘤多藥耐藥的機制首先要在體內(nèi)外建立骨肉瘤多藥耐藥的模型。耐藥模型的建立的方法一般有兩種:成熟細(xì)胞系誘導(dǎo)或者耐藥骨肉瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)。其中前者更具有穩(wěn)定性、代表性和說服力。SaOS-2、U2OS是研究常用的人骨肉瘤細(xì)胞系，但由于其體內(nèi)致瘤率低而不利于體內(nèi)實驗的進(jìn)行，因此我們還選取了具有較高致瘤性的MNNG/HOS人骨肉瘤細(xì)胞系，通過化療藥物誘導(dǎo)建立此三種細(xì)胞系的骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞模型，這在國內(nèi)外尚屬首

3、例。
　　 骨肉瘤干細(xì)胞是骨肉瘤中一小群具有自我更新和分化功能的細(xì)胞。通常這部分細(xì)胞處于靜止期，當(dāng)受到刺激或者周圍微環(huán)境改變時，它就會不斷增殖分化成異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞。骨肉瘤干細(xì)胞具有無限增殖、多藥耐藥和高致瘤性等特點，常規(guī)治療方法很難將其殺滅，所以它們被看做是骨肉瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)住?br>　　 研究表明，骨肉瘤干細(xì)胞可表達(dá)特殊的表面標(biāo)志，例如CD133、CD105和Stro-1等。目前對于骨肉瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記的研

4、究尚處于起步階段，存在較多的爭論，但是比較公認(rèn)的觀點是根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志不同而分離出的干細(xì)胞均處于決定腫瘤細(xì)胞分化方向的重要階段，它們對腫瘤的生長、侵襲、耐藥、復(fù)發(fā)起著決定作用。因此進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)骨肉瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志，對于研究腫瘤干細(xì)胞的形成機制和耐藥機制具有重大意義。低親和力神經(jīng)生長因子受體CD271，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記，近來研究發(fā)現(xiàn)它也是黑色素瘤和乳腺癌的干細(xì)胞標(biāo)記，而骨肉瘤干細(xì)胞與CD271的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未見研究報

5、道。
　　 腫瘤多藥耐藥機制復(fù)雜多樣，與ABC轉(zhuǎn)運蛋白、TOPOⅡ、癌基因Bcl-2、P53、NF-κB等因素有關(guān)。其中MDR1(P-gp)被認(rèn)為是包括骨肉瘤在內(nèi)多種腫瘤發(fā)生多藥耐藥的主要原因，它能將化療藥物逆濃度梯度排出在細(xì)胞外，從而增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性。研究骨肉瘤耐藥細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞中MDR1(P-gp)的表達(dá)和功能有助于闡明骨肉瘤的耐藥機制，為尋找逆轉(zhuǎn)耐藥提供新方法。
　　 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥是所有耐藥研究

6、的根本目的，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤多藥耐藥也是目前研究的熱點。逆轉(zhuǎn)骨肉瘤多藥耐藥的方法包括化學(xué)藥物和中藥制劑逆轉(zhuǎn)、免疫抗體逆轉(zhuǎn)、基因干擾逆轉(zhuǎn)等。由于中藥活性成分逆轉(zhuǎn)作用可靠，毒副作用小，易于獲得，因此中藥活性成分對于骨肉瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的作用及機制成為研究的熱點。姜黃素有幾百年的應(yīng)用歷史，具有廣泛的抗腫瘤活性，在體外能夠逆轉(zhuǎn)L1210/Adr、SGC7901/VCR、KB-V1和U2OS/AMD等腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。因此研究姜黃素逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞多藥耐藥

7、的作用及其機制，可為骨肉瘤的治療尋僻新的途徑。
　　 第一部分:
　　 人類骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞系SaOS-2/MTX，U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX的建立與驗證
　　 目的:
　　 1.誘導(dǎo)人類骨肉瘤耐藥細(xì)胞系SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX;
　　 2.驗證SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX的多藥耐藥性，形成穩(wěn)定的人類骨肉

8、瘤多藥耐藥細(xì)胞系，為后續(xù)研究骨肉瘤多藥耐藥機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.以甲氨蝶呤(Amethopterin，MTX)為誘導(dǎo)劑，采用化療藥物沖擊并且逐步增加藥物濃度的方法，誘導(dǎo)人類骨肉瘤細(xì)胞系（SaOS-2，U2OS和MNNG/HOS），并建立耐甲氨喋呤的人骨肉瘤細(xì)胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX);
　　 2.利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)的變化，以培養(yǎng)天數(shù)為橫軸

9、、細(xì)胞數(shù)量為縱軸繪制生長曲線，比較耐藥細(xì)胞系與其母代細(xì)胞系在形態(tài)和增殖能力上的變化;
　　 3.MTT法分別檢測耐藥細(xì)胞株(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)對MTX、阿霉素(Doxorubicin，ADM)、表柔比星(Epirubicine，EPI)、順鉑(Cisplatin，DDP)和異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide，IFO)的藥物敏感性:計算其半數(shù)抑制濃度(halfmaximalinhibi

10、toryconcentration,IC50)和耐藥指數(shù)(resistanceindex，RI)，觀察各耐藥細(xì)胞系對骨肉瘤常見化療藥物的耐藥性;
　　 4.利用Real-timePCR和Westernblot技術(shù)分析骨肉瘤細(xì)胞耐藥前后MDR1基因表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)過6個月的誘導(dǎo)，建立人骨肉瘤耐MTX細(xì)胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)，耐藥細(xì)胞系能在含有

11、2000ng/mlMTX的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長、增殖、傳代;
　　 2.顯微鏡下觀察SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX細(xì)胞，細(xì)胞系表現(xiàn)出與母代細(xì)胞系相似的特征，但部分細(xì)胞體積增大，多形細(xì)胞、多核和巨核細(xì)胞增多;細(xì)胞生長曲線顯示耐藥細(xì)胞系生長曲線較母代細(xì)胞系平緩，增殖速度減慢;
　　 3.MTT法檢測結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞針對各化療藥物的IC50(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HO

12、S/MTX)值與非耐藥細(xì)胞IC50(SaOS-2，U2OS和MNNG/HOS)相比在統(tǒng)計學(xué)上均有顯著差異(P＜0.05)。觀察各藥物耐藥指數(shù)，SaOS-2/MTX對MTX為高度耐藥，對ADM、EPI為中度耐藥，對DDP、IFO為輕度耐藥;U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX對MTX和ADM為中度耐藥，對EPI、DDP和IFO為低度耐藥;
　　 4.Real-timePCR和Westernblot結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞系(SaOS

13、-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)中多藥耐藥基因(Multipledrugresistance1，MDR1)的表達(dá)比非耐藥細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過MTX沖擊誘導(dǎo)的人類骨肉瘤耐藥細(xì)胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)具有多藥耐藥的特性，對MTX、ADM、EPI、DDP、IFO均有不同程度耐藥，并能穩(wěn)定培養(yǎng)傳代能夠滿足后續(xù)試驗需要

14、;
　　 2.耐藥細(xì)胞系基本保持了與母代細(xì)胞系相似的特性，但是部分細(xì)胞形態(tài)略有改變，增殖變慢;
　　 3.骨肉瘤的多藥耐藥與MDR1的表達(dá)有密切的關(guān)系，MDR1過表達(dá)可能是骨肉瘤多藥耐藥的主要原因之一。
　　 第二部分:
　　 CD133+或CD271+骨肉瘤細(xì)胞介導(dǎo)骨肉瘤多藥耐藥的體內(nèi)外相關(guān)研究
　　 目的:
　　 1.鑒定骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX，M

15、NNG/HOS/MTX)中腫瘤干細(xì)胞的存在;
　　 2.分析驗證CD133或CD271與骨肉瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系;
　　 3.比較研究骨肉瘤耐藥細(xì)胞系和非耐藥細(xì)胞系中干細(xì)胞的變化，探討骨肉瘤干細(xì)胞在骨肉瘤多藥耐藥中的作用和機制。
　　 方法:
　　 1.利用免疫組化技術(shù)研究骨肉瘤患者臨床病理標(biāo)本中CD271的表達(dá)情況;
　　 2.用骨肉瘤耐藥細(xì)胞系（SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/

16、HOS/MTX）和非耐藥細(xì)胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)制備細(xì)胞爬片，進(jìn)行CD271的免疫組化染色，比較觀察二者之間CD271的表達(dá)變化;
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測骨肉瘤細(xì)胞系SaOS-2、U2OS、HOS、SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271的表達(dá)比率，分析細(xì)胞耐藥前后CD133或CD271表達(dá)變化;
　　 4.磁珠分選技術(shù)分別分選SaOS-2/MT

17、X、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性的細(xì)胞;
　　 5.將各耐藥細(xì)胞系CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細(xì)胞分別種入低吸附六孔板中進(jìn)行無血清培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的單克隆成球率;
　　 6.Real-timePCR和Westernblot分別檢測耐藥細(xì)胞系中CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細(xì)胞中MDR1、Nanog和OCT4基因的的表達(dá)差異;
　　 7.體內(nèi)實驗檢測

18、骨肉瘤干細(xì)胞致瘤性:將各骨肉瘤耐藥細(xì)胞系中CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細(xì)胞分別植入4周大小BALB/c裸鼠中（每組5只，共30只），觀察裸鼠的成瘤率。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同類型的骨肉瘤標(biāo)本中均有不同程度的CD271陽性細(xì)胞表達(dá);
　　 2.細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示CD271在六種骨肉瘤細(xì)胞系中均有不同程度表達(dá)，其中耐藥細(xì)胞系(SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)中的

19、表達(dá)高于非耐藥細(xì)胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)(P＜0.05);
　　 3.流式細(xì)胞儀分析顯示耐藥細(xì)胞系中CD133或CD271的表達(dá)比例明顯高于非耐藥細(xì)胞系，其中CD133和CD271的表達(dá)趨勢相似;
　　 4.磁珠分選成功從耐藥細(xì)胞系SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中分選出CD133陽性和CD271陽性細(xì)胞，無血清培養(yǎng)結(jié)果顯示CD133陽性或CD271陽性細(xì)胞的成球率

20、顯著高于陰性細(xì)胞;
　　 5.Real-timePCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)MDR1、Nanog和OCT4基因在CD133陽性和CD271陽性細(xì)胞中顯著表達(dá)(P＜0.05);
　　 6.體內(nèi)實驗顯示，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)種植成瘤的幾率要明顯高于CD133或CD271陰性細(xì)胞，而SaOS-2/MTX細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有種植瘤生長的情況。
　

21、　 結(jié)論:
　　 1.CD271陽性細(xì)胞在骨肉瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中存在，其表達(dá)比例較CD133略高;
　　 2.CD133或CD271陽性骨肉瘤細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中成球，在裸鼠體內(nèi)致瘤，具有干細(xì)胞的某些特性，CD271可能是骨肉瘤干細(xì)胞的一個新的表面標(biāo)記;
　　 3.耐藥細(xì)胞系SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中腫瘤干細(xì)胞（CD133或CD271陽性）的比例增加，干細(xì)胞特征性基因(N

22、anog或OCT4)的表達(dá)也明顯升高，說明骨肉瘤干細(xì)胞參與了骨肉瘤多藥耐藥過程，并在其中可能發(fā)揮主要作用;
　　 4.骨肉瘤多藥耐藥的主要機制可能是骨肉瘤干細(xì)胞過表達(dá)MDR1(P-gp)引起的多化療藥物耐受。
　　 第三部分:
　　 姜黃素逆轉(zhuǎn)骨肉瘤干細(xì)胞多藥耐藥的體內(nèi)外相關(guān)研究
　　 目的:
　　 1.體外實驗觀察姜黃素逆轉(zhuǎn)人骨肉瘤SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX

23、細(xì)胞多藥耐藥的作用;
　　 2.體內(nèi)實驗觀察姜黃素逆轉(zhuǎn)MNNG/HOS/MTX細(xì)胞系耐藥，增敏化療藥物的作用;
　　 3.探討姜黃素逆轉(zhuǎn)骨肉瘤多藥耐藥的相關(guān)作用機制;
　　 4.觀察在多藥耐藥逆轉(zhuǎn)過程中骨肉瘤干細(xì)胞的變化，進(jìn)一步分析骨肉瘤多藥耐藥的根本機制和逆轉(zhuǎn)方法。
　　 方法:
　　 1.通過MTT法檢測姜黃素對骨肉瘤耐藥細(xì)胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX

24、)的影響;
　　 2.選取30μM濃度的姜黃素進(jìn)行逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥細(xì)胞系多藥耐藥的體外實驗，觀察其逆轉(zhuǎn)效果;
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測姜黃素聯(lián)合MTX作用前后，骨肉瘤耐藥細(xì)胞系（SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX）中腫瘤干細(xì)胞(CD133或CD271陽性)比例的變化;
　　 4.將SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX分別經(jīng)過0、10、20、30、40μM的姜

25、黃素刺激后，通過Real-timePCR和Westernblot檢測MDR1基因表達(dá)的變化;
　　 5.共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測姜黃素對SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX細(xì)胞內(nèi)羅丹明123（Rhodamine123，Rh123）積聚和外排的影響。
　　 6.體內(nèi)實驗:磁珠分選MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性細(xì)胞接種子20只BALB/c裸鼠中，一周后應(yīng)用MTX（MTX組

26、）或姜黃素聯(lián)合MTX(Cur/MTX)進(jìn)行干預(yù)，4周后處死老鼠觀察成瘤率、腫瘤體積大小，對種植瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查，并檢測種各組種植瘤中Nanog、OCT4和MDR1基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.30μM濃度以下的姜黃素對骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞影響較小;
　　 2.通過MTT法計算各化療藥物的IC50和RI顯示30μM姜黃素能不同程度逆轉(zhuǎn)SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX對各化療

27、藥物的耐藥性;
　　 3.姜黃素聯(lián)合MTX作用于耐藥細(xì)胞，能夠增敏化療藥物并殺傷骨肉瘤耐藥細(xì)胞系中的干細(xì)胞，降低其比例;
　　 4.Real-timePCR和Westernblot結(jié)果顯示，姜黃素能濃度依賴性的下調(diào)耐藥細(xì)胞株SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中MDR1的表達(dá);
　　 5.共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測顯示姜黃素能增加Rh123在SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和M

28、NNG/HOS/MTX細(xì)胞內(nèi)的聚集，抑制Rh123的外排，且呈濃度依賴關(guān)系;
　　 6.體內(nèi)試驗顯示，姜黃素能在體內(nèi)增加MTX的敏感性，降低腫瘤干細(xì)胞的成瘤率和下調(diào)Nanog、OCT4和MDR1基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.姜黃素在體外可有效逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥細(xì)胞系SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX的多藥耐藥現(xiàn)象;
　　 2.姜黃素在體內(nèi)外能增敏化療藥物，殺傷骨肉瘤干細(xì)胞