模擬微重力培養(yǎng)骨髓間充質干細胞定向誘導復合支架修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)傷和各種疾病引起的關節(jié)軟骨缺損對患者生活質量影響很大。因此多年來，骨科醫(yī)生致力于探索和完善修復和重建符合關節(jié)軟骨解剖和功能的方法。曾用自體或同種異體軟骨及人工替代材料應用于臨床，但因材料來源、供區(qū)缺損、免疫排斥等方面存在不足，組織工程技術的發(fā)展有可能避免傳統(tǒng)治療方法的缺陷，解決修復與重建軟骨缺損之一難題。組織工程技術需要大量的種子細胞和良好的細胞支架材料，才能滿足工程化組織或器官的生成和塑形要求。種子細胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，細

2、胞主要來源于自體、同種異體、異種組織細胞等。自體組織細胞應列為首選。由于軟骨組織工程多需要高濃度的細胞接種，自體軟骨細胞存在著數(shù)量上的局限性及長期傳代后細胞功能老化的問題。干細胞工程是利用現(xiàn)代生物醫(yī)學和組織工程技術，通過對干細胞進行體外分離純華、定向誘導分化、大量擴增和整合構建，在體外重建組織和器官。干細胞是指那些具有自我復制能力，并且可以通過不可逆的終末分化過程產生子代細胞的細胞，產生多種組織細胞的表達。骨髓間充質干細胞是目前的干細胞

3、研究中的一個熱點，它具有分化成多種中胚層組織，包括骨與軟骨組織、肌腱、肌肉、脂肪、神經、皮膚組織以及骨髓基質組織。組織培養(yǎng)中環(huán)境控制是其中的難點，力學因素是組織工程中的重要影響因素之一，近年來的研究表明，力學作用可以刺激細胞因子及激素的分泌，改變三維支架上培養(yǎng)的種子細胞的新陳代謝，從而促進組織的生長與重建。依照仿生學的觀點，用于關節(jié)軟骨組織工程的力學環(huán)境需要三個條件：1，對接種在三維支架上的細胞提供足夠的力學刺激；2，保證細胞營養(yǎng)和排泄

4、物的有效物質轉運；3，促進功能性細胞外基質在三維支架中的分泌合成。隨著太空航天技術的發(fā)展，微重力組織工程技術的誕生，為建立三維細胞培養(yǎng)體系開創(chuàng)了新時代，轉壁式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬了微重力培養(yǎng)環(huán)境，降低了培養(yǎng)液對細胞產生的機械剪切力，保證了細胞營養(yǎng)和排泄物的轉運，促進了在其中的細胞表現(xiàn)出三維增殖與細胞分化，滿足了細胞在可吸收聚合物中的營養(yǎng)需要，減少處于中心部位的細胞由于營養(yǎng)不良或代謝不暢而導致的生長遲滯甚至死亡，使細胞周圍更接近在體內生理環(huán)境

5、。 研究目的: 將兔BMSCs定向誘導為軟骨細胞，復合經過抑肽酶和氨甲環(huán)酸改良的纖維蛋白膠（FG）細胞支架，構成軟骨細胞一支架復合物，然后利用旋轉培養(yǎng)儀進行軟骨細胞-支架復合物模擬微重力培養(yǎng)，觀察復合材料內軟骨細胞在動物體外的生長情況、改良支架材料的降解特性，以及組織工程軟骨細胞外基質分泌的相關情況與其在體內實驗修復關節(jié)軟骨缺損的相關情況，探索在模擬微重力環(huán)境下改良軟骨模塊修復關節(jié)軟骨缺損的效用及其可能的臨床應用價值。

6、 研究方法: 一、動物體外實驗部分：1．取3周齡新西蘭幼兔的兔骨髓MSCs，體外分離培養(yǎng)，擴增及誘導分化為軟骨細胞，將制取的軟骨細胞，體外單層培養(yǎng)、擴增后種植于改良FG支架上，構建細胞改良FG支架復合物。2．將復合物分成兩組：旋轉培養(yǎng)組、和普通對照組。旋轉培養(yǎng)組利用旋轉培養(yǎng)儀進行模擬微重力培養(yǎng)，普通對照組在23孔板靜止培養(yǎng)，均在體外進行2周的培養(yǎng)、擴增。觀察軟骨細胞的形態(tài)變化，繪制細胞生長曲線，光鏡和透射電鏡下的形態(tài)學觀察

7、，了解模擬微重力對細胞改良FG支架復合物培養(yǎng)的影響。 二、動物體內實驗部分：將48只雙側膝關節(jié)軟骨缺損的3月齡新西蘭兔動物模型隨機分為4組。在A組、B組和C組的關節(jié)軟骨缺損中分別植入在模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)的細胞改良FG支架復合物、普通環(huán)境下培養(yǎng)的細胞改良FG支架復合物以及無細胞的單純改良FG支架，D組為空白對照組。術后第2、6、12周取材，進行大體評測，組織形態(tài)學及超微結構檢測，并觀察載體降解情況，于第12周標本按照Wakira

8、ni標準進行組織工程學評分，然后對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 研究結果: 1．倒置顯微鏡下的觀察結果：原代培養(yǎng)的BMSCs細胞48 h內大部分貼壁，細胞呈形態(tài)較一致的短梭形、多邊形，3～5 d時可見明顯集落形成，增殖速度快，7-8天左右細胞互相融合，細胞呈成纖維細胞樣，排列呈螺旋狀、魚群狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)的BMSCs貼壁很快（12h內大多數(shù)細胞已貼壁），呈長梭形，形態(tài)更加均勻，生長旺盛，3-4d左右即可達到90%融合，7

9、d左右生長逐漸緩慢。兩組復合物的細胞生長曲線有顯著差別。 2．大體標本及組織學觀察：術后第2周，各實驗組內可見種植的模塊，邊界清楚，與周圍組織未融合，無一例種植塊脫落?？瞻捉M內只見少許淤血塊。術后6周，微重力培養(yǎng)系統(tǒng)組實驗側可見不典型的透明軟骨組織，軟骨細胞位于陷窩中，細胞數(shù)量較多，排列較為規(guī)則，可見分區(qū)，甲胺藍染色陽性基質含量較高，局部可見少許淋巴細胞浸潤，關節(jié)軟骨缺損部修復面約為正常軟骨的3/5～3/4，表面較為平整；普通培

10、養(yǎng)細胞支架組側亦可見不典型透明軟骨組織，軟骨細胞位于陷窩中，細胞數(shù)量較多，排列不規(guī)則，甲胺藍染色陽性基質較前組為少，修復面平整，修復組織厚度大約為鄰近軟骨的1/3～3/5；單純支架側為纖維組織覆蓋，表面凹凸不平，凹陷明顯，周圍邊界清楚，在單純支架組偶有類纖維軟骨形成，并有吞噬降解材料的巨噬細胞出現(xiàn)，而在完全空白組表面可見一薄層組織敷蓋，主要為一纖維疤痕及炎性組織敷蓋。術后12周，微重力培養(yǎng)系統(tǒng)組實驗側修復軟骨與鄰近軟骨整合緊密、厚度相近

11、、細胞位于軟骨陷窩中，數(shù)量較正常軟骨為多，富含甲苯胺藍染色陽性基質，修復軟骨結構與正常軟骨相似，表層細胞呈橢圓形，長軸與關節(jié)面平行，中間細胞呈圓形，放射區(qū)內細胞有柱狀排列趨勢；普通培養(yǎng)支架組側亦可見部分透明軟骨組織，軟骨細胞位于陷窩中，細胞數(shù)量尚可，排列欠規(guī)則，甲胺藍染色陽性基質較前增多，修復面較為平整，部分修復組織厚度大約為鄰近軟骨3/5，2例標本修復表面可見少許凹陷，單純支架組為纖維組織覆蓋，表面凹凸不平，凹陷明顯，周圍邊界清楚，在

12、單純支架組偶有類纖維軟骨形成，并有吞噬降材料的巨噬細胞出現(xiàn)；空白組內為——松散的纖維疤痕組織敷蓋及部分炎性細胞的存在。軟骨缺損修復的組織工程學評分：第12周標本按照Wakitani評分法對于各期關節(jié)軟骨缺損動物模型體內組織工程軟骨塊植入后的修復進行評分，進行組織工程學軟骨修復評分。 結論: 1．兔BMSCs定向誘導為軟骨細胞作為種子細胞適用于組織工程修復軟骨的缺損。 2．在體外環(huán)境下，模擬微重力組的細胞生長繁殖周