基因沉默對肝衰竭內(nèi)毒素血癥小鼠肝細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　肝衰竭是各種原因?qū)е碌母喂δ車?yán)重失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、腹水、肝性腦病、肝腎綜合征和出血等為主要表現(xiàn)的一種臨床癥候群，死亡率高達(dá)80％，目前尚缺乏特異的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要事件。肝衰竭時(shí)內(nèi)毒素血癥發(fā)生率高達(dá)80.0％，內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）可以介導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第2個(gè)線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria

2、derived activator of caspase,SMAC)在體外可以單獨(dú)介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，體內(nèi)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)肝衰竭內(nèi)毒素血癥大鼠肝細(xì)胞的凋亡與SMAC密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)SMAC是凋亡的發(fā)生發(fā)展所必須的。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效、特異性阻斷mRNA表達(dá)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。應(yīng)用RNAi抑制SMAC的表達(dá)，可能減輕肝衰竭內(nèi)毒素血癥小鼠肝細(xì)胞的凋亡，這將為肝衰竭內(nèi)毒素血癥的治療提

3、供一個(gè)新的途徑，也有助于進(jìn)一步明確SMAC在該凋亡中的作用。最后，研究HEV相關(guān)急性肝衰竭患者血清LPS水平，觀察該血清對人肝細(xì)胞生存和凋亡的影響，并初步探討內(nèi)毒素核心多糖抗體的保護(hù)作用。
　　方法：
　　一.細(xì)胞水平
　　針對人SMAC基因設(shè)計(jì)、合成并篩選出特異小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA)，脂質(zhì)體法將該特異干擾片段轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，再用內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)（24h

4、、36h、48h、60h）收集肝細(xì)胞，Real time PCR法檢測細(xì)胞SMAC mRNA。轉(zhuǎn)染后48h，western檢測肝細(xì)胞線粒體SMAC蛋白和胞漿caspase-9蛋白的表達(dá)，caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞的凋亡。
　　二.動(dòng)物水平
　　構(gòu)建小鼠SMAC特異干擾慢病毒，測序鑒定構(gòu)建的正確性并測定其滴度。通過尾靜脈高壓注射技術(shù)將慢病毒導(dǎo)入小鼠肝臟。應(yīng)用D-半乳糖氨(D

5、-galactosanine，D-GalN)和LPS腹腔注射制作急性肝衰竭小鼠模型，觀察小鼠體征的變化并記錄小鼠死亡情況，留取小鼠血液和肝臟組織。全自動(dòng)生化分析儀檢測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST），鱟試劑檢測試劑盒檢測血清LPS水平，冰凍切片檢測慢病毒的感染效率，HE染色評定肝組織病理學(xué)改變，real time P

6、CR法檢測肝組織SMAC mRNA，western檢測肝組織線粒體和胞漿SMAC蛋白、caspase-9蛋白的表達(dá)，Tunel染色觀察肝組織肝細(xì)胞的凋亡。
　　三.人體水平
　　收集13例HEV相關(guān)急性肝衰竭患者血清，采用鱟試劑基質(zhì)顯色法檢測血清LPS水平，用該血清孵育肝細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞凋亡率；再用內(nèi)毒素核心多糖抗體和該急性肝衰竭患者血清與肝細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞凋亡率。
　　四.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

7、　　計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行多樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)方差分析，比較各樣本間的差異。P<0.05為顯著性差異界限。
　　結(jié)果：
　　1.3條siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）對人肝細(xì)胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用，其中siRNA2的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，抑制效應(yīng)達(dá)68.0％。
　　2.在轉(zhuǎn)染siRNA2的LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞，線粒體SMAC蛋白、ca

8、spase-9蛋白、caspase-3酶活性均被抑制，肝細(xì)胞的凋亡率也被有效降低。
　　3.篩選并構(gòu)建了特異的小鼠SMAC干擾慢病毒載體，測序表明其構(gòu)建正確，慢病毒滴度為6E+8 TU/ml。
　　4.熒光顯微鏡下，注射慢病毒的小鼠肝臟組織冰凍切片可見大量綠色熒光。
　　5.模型組小鼠血清ALT和AST水平較正常對照組明顯上升，特異序列組小鼠ALT和AST水平較模型組顯著降低。
　　6.模型組小鼠血清LPS水平較

9、正常對照組明顯升高，特異序列組小鼠血清LPS水平較模型組顯著下降。
　　7.HE染色顯示，正常對照組小鼠肝組織無炎性細(xì)胞浸潤，無肝細(xì)胞壞死；模型組和無關(guān)序列組小鼠肝組織可見炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死；而特異序列組小鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死較模型組明顯減少。
　　8.在肝衰竭模型小鼠，肝組織SMAC mRNA的表達(dá)水平較正常對照組小鼠明顯升高，線粒體SMAC蛋白表達(dá)降低，胞漿SMAC蛋白表達(dá)明顯增多，肝組織胞漿 casp

10、ase-9蛋白表達(dá)量較正常組明顯增多，肝細(xì)胞凋亡增多，凋亡指數(shù)為33.0±5.6％。而構(gòu)建的特異慢病毒，可以顯著降低肝組織SMAC mRNA的水平，下調(diào)線粒體和胞漿SMAC蛋白的表達(dá)，降低caspase-9的含量，減少肝組織肝細(xì)胞的凋亡。
　　9.HEV相關(guān)急性肝衰竭患者的血清LPS水平為0.26±0.02EU/ml，明顯高于健康者。
　　10.HEV相關(guān)急性肝衰竭患者血清孵育肝細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率為5.83±0.42％，較

11、對照組明顯增加，健康者的血清對細(xì)胞凋亡率沒有明顯影響。應(yīng)用LPS抗體和急性肝衰竭患者血清共培養(yǎng)，細(xì)胞凋亡率下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.通過抑制SMAC的表達(dá)，可以有效減少LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的凋亡及肝衰竭內(nèi)毒素血癥小鼠肝細(xì)胞的凋亡，為肝衰竭內(nèi)毒素血癥的治療提供了新的手段和理論基礎(chǔ)。同時(shí)也表明SMAC及其下游通路可能是LPS介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的通路之一。
　　2.HEV相關(guān)急性肝衰竭患者血清含有較高濃度的LP