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文檔簡介
1、內(nèi)毒素又稱脂多糖(LPS),是革蘭陰性細菌外膜的主要成分。內(nèi)毒素血癥及與其有關(guān)的急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)是病人感染死亡的重要原因。脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)在炎癥中具有雙刃劍的作用,一方面,當LBP的致炎位點與LPS的類脂A結(jié)合時,表現(xiàn)為信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo),核轉(zhuǎn)錄因子激活,炎癥介質(zhì)生成,導(dǎo)致過激炎癥反應(yīng)發(fā)生;另一方面,當LBP的抗炎位點與LPS的類脂A結(jié)合時,LBP將LPS傳遞給脂蛋
2、白或靶細胞,使LPS被中和或者被靶細胞清除,表現(xiàn)為抗炎作用。因為LBP作用的雙重性,應(yīng)用LBP或抗LBP抗體治療內(nèi)毒素血癥均有一定的局限性,所以若僅阻斷LBP的致炎作用、保留其抗炎作用,則能提高內(nèi)毒素血癥的治療效果。我們實驗室用噬菌體隨機12肽庫篩選獲得了可與LBP競爭結(jié)合LPS的噬菌體克隆,其核心序列與LBP的91~102位氨基酸(WKVRKSFFKLQG)有明顯同源性,推測該位點為LBP的致炎位點。應(yīng)用FMOC固相法合成12肽WKV
3、RKSFFKLQG-NH2,即為LBP抑制肽(簡稱P12)。推測LBP抑制肽能與LBP的致炎位點競爭結(jié)合LPS,從而起抗炎作用。基于上述假說和以前的研究基礎(chǔ),我們進一步就LBP抑制肽對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的U937細胞和內(nèi)毒素血癥小鼠的作用及機制進行探討。 一、實驗方法:本實驗包括體內(nèi)和體外兩部分。 1.體外試驗:以人單核巨噬細胞株U937細胞為研究對象。根據(jù)實驗設(shè)計方案,U937細胞被分為對照組、LPS組(分為100ng/ml的
4、小劑量組和1μg/ml的大劑量組)及P12組(分為小、中、大劑量組)。 (1)央心ELISA檢測P12與LPS的相對親和力。 (2)流式細胞檢測分析(FACS)異硫氰酸熒光素標記的LPS(FITC-LPS)與U937細胞的結(jié)合。 (3)RT-PCR和Westernblotting(WB)檢測U937細胞膜受體CD14和跨膜受體鐘形受體4(TLR4)mRNA和蛋白的表達。 (4)免疫細胞化學(xué)(ICC)和WB
5、聯(lián)合檢測定量反映核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)的活化程度。 (5)ELISA和硝酸還原酶法檢測U937細胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的含量。 2.體內(nèi)試驗:在體外實驗的基礎(chǔ)上,進一步研究P12對內(nèi)毒素血癥小鼠的保護作用及其機制。小鼠隨機分為對照組、內(nèi)毒素血癥組及P12組。 (1)D-半乳糖致敏小鼠,LPS腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素血癥小鼠模型。 (2)支氣管肺泡灌洗分離肺泡巨
6、噬細胞(AMs)。 (3)肺組織切片,HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變。 (4)FACS檢測FITC-LPS與AMs的結(jié)合。 (5)免疫組織化學(xué)(IHC)和WB定量分析小鼠肺組織NF-κB的活化程度。 (6)ELISA和硝酸還原酶法檢測小鼠血漿中TNF-α和NO的含量。 (7)觀察P12對內(nèi)毒素血癥小鼠生存率的影響。 二、實驗結(jié)果1.體外實驗(1)在相同的質(zhì)量濃度下,P12與LPS的親合力比L
7、BP高,約為LBP的1.15倍。 (2)P12抑制了FITC-LPS與U937細胞的結(jié)合,阻止了LPS的內(nèi)在化。 (3)RT-PCR和WB結(jié)果顯示:大劑量LPS(1μg/ml)與小劑量LPS(100ng/ml)相比所引起的CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達無明顯差異(P均>0.05);另外P12降低了LPS誘導(dǎo)的CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達。 (4)與CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達趨勢
8、不一致,大劑量LPS引起NF-κB的活化程度較小劑量LPS組明顯增加(P<0.05);P12抑制了小劑量LPS引起的NF-κB的活化,對大劑量LPS引起的NF-κB的活化無明顯抑制作用。 (5)與NF-κB活化趨勢一致,大劑量LPS引起TNF-α和NO的生成量較小劑量LPS組明顯增加(P均<0.05);P12能抑制小劑量LPS誘導(dǎo)的U937細胞TNF-α和NO的生成,但對大劑量LPS引起的TNF-α和NO的生成無明顯抑制作用。
9、 2.體內(nèi)實驗(1)病理學(xué)結(jié)果顯示:P12顯著減輕了內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織的炎性反應(yīng)。 (2)P12明顯抑制了FITC-LPS與AMs的結(jié)合,減輕了LPS的內(nèi)在化。 (3)P12阻止了內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織NF-κB的活化;降低了小鼠血漿TNF-α及NO的含量。(4)P12降低了內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。三、結(jié)論1.LBP抑制肽對小劑量LPS(100ng/ml)引起的過激炎癥反應(yīng)有抑制作用,并降低了內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率
10、。 2.其作用機制可能是LBP抑制肽阻止了LBP致炎信號的傳導(dǎo)。(1)LBP抑制肽通過與LBP的致炎位點競爭結(jié)合LPS而抑制了LPS與單核巨噬細胞的結(jié)合,阻止了LPS的內(nèi)在化。 (2)LBP抑制肽通過下調(diào)LPS受體CD14和TLR4mRNA和蛋白的表達、減弱NF-κB的活化、減少TNF-α和NO的生成而抑制靶細胞的激活。3.LBP抑制肽對大劑量LPS(1μg/ml)引起的NF-κB活化及TNF-α和NO的生成無顯著抑制作
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