p62-Keap1-Nrf2-ARE通路在煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過(guò)程中的作用.pdf

1、目的：
　　 目前流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)煤焦瀝青(CoalTarPitch,CTP)具有致癌性，特別是對(duì)肺癌具有高度選擇性。在正常細(xì)胞中，Keap1-Nr2/ARE通路調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。另有研究顯示多功能蛋白p62/SQSTM1(Sequestosome1)可能參與Keap1-Nrf2/ARE通路的調(diào)節(jié)，因此p62-Keap1-Nrf2/ARE通路在抗腫瘤方面可能具有重要作用。該研究主要

2、利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用RNA干擾（RNAInterfering，RNAi）技術(shù)沉默人支氣管上皮細(xì)胞(HumanBronchialEpithelialCells，BEAS-2B)中Nr2基因的表達(dá)，建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，隨后建立CTP煙提取物誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，在確定細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，動(dòng)態(tài)觀察不同代次細(xì)胞Keap1-Nrf2/ARE通路中相關(guān)基因及蛋白的改變，探討CTP煙提取物致細(xì)胞

3、發(fā)生惡性改變過(guò)程中p62-Keap1-Nrf2/ARE通路的作用機(jī)制，為尋找可能發(fā)生癌變的關(guān)鍵階段及揭示肺癌發(fā)生機(jī)制提供線索。
　　 方法：
　　 1.采用G418測(cè)定BEAS-2B細(xì)胞對(duì)其最低耐受濃度;小干擾RNA(SmallInterferingRNA，siRNA)通過(guò)RNAi-Mate轉(zhuǎn)染，從4條siRNA序列中篩選出1條沉默Nrf2基因的最佳序列，熒光顯微鏡觀察及RT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果;細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2重組

4、質(zhì)粒過(guò)程中將細(xì)胞分為目的基因?qū)嶒?yàn)(siRNA)組、空白對(duì)照組、G418對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照(mock)組，RNAi技術(shù)沉默BEAS-2B細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)，G418抗性篩選BEAS-2B細(xì)胞Nrf2基因沉默穩(wěn)定表達(dá)株，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf2mRNA的表達(dá)量。
　　 2.以BEAS-2B細(xì)胞為靶細(xì)胞，設(shè)立二甲基亞砜（DimethylSulfoxide，DMSO）陰性對(duì)照組、苯并(a)芘(Benzo(a)pyren

5、e，B(a)P)陽(yáng)性對(duì)照組、煤焦瀝青煙提取物染毒(CTP)組、RNAi組，建立細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞惡變情況，采用RT-PCR、Westernblot技術(shù)分別檢測(cè)10代、20代、30代細(xì)胞p62、Keap1、Nrf2、NQO1基因和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.BEAS-2B細(xì)胞RNAi處理
　　 G418最佳篩選濃度為400μg/ml;沉默Nrf2最佳的siRNA序列為Nrf2

6、-homo-001;G418篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中siRNA組Nrf2mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組、G418對(duì)照組和mock組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），空白對(duì)照組與G418組、mock組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.801;P=0.184)，G418組與mock組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125)。
　　 2.軟瓊脂克隆形成
　　 各組細(xì)胞10代時(shí)克隆數(shù)30個(gè)以內(nèi);20

7、代時(shí)RNAi組克隆形成率顯著高于CTP組和B(a)P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）;B(a)P組克隆形成率與CTP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066);30代時(shí)，RNAi組克隆形成率顯著高于CTP組和B(a)P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），而CTP組克隆形成率高于B(a)P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 3.p62、Keap1、Nrf2、NQO1基因和蛋白的表達(dá)情況
　　

8、CTP煙提取物作用于BEAS-2B細(xì)胞后，隨傳代次數(shù)增加，B(a)p組、CTP組和RNAi組p62的mRNA和蛋白水平上調(diào);Keap1蛋白表達(dá)下調(diào);B(a)p組和CTP組Nrf2的mRNA水平變化不顯著，但兩組的Nrf2蛋白水平上調(diào)，RNAi組Nrf2的mRNA和蛋白水平一直處于較低水平;B(a)P組、CTP組和RNAi組抗氧化基因NQO1的mRNA和蛋白水平均上調(diào)，但RNAi組的表達(dá)量顯著低于B(a)P組和CTP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（均P＜0.001）。
　　 結(jié)論：
　　 CTP煙提取物作用于BEAS-2B細(xì)胞，隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞發(fā)生惡變;CTP煙提取物刺激BEAS-2B細(xì)胞，激活了Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路;抑制Nrf2基因的表達(dá)能夠促進(jìn)CTP煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡變;p62可能參與Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，同時(shí)還存在其他通路參與NQO1的調(diào)控。綜上，p62-Keap1-Nrf2/ARE通路可能通過(guò)上