Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路在自噬調(diào)控酒精誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖活化中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對(duì)酒精誘導(dǎo)下肝星狀細(xì)胞增殖活化的影響,并探討Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路在自噬調(diào)控酒精誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化中的地位,為抗酒精性肝纖維化提供新的研究思路及藥物研發(fā)靶點(diǎn)。
　　方法：該研究以含酒精的培養(yǎng)基處理大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6以建立體外酒精誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化模型;將自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤處理HSC-T6細(xì)胞,觀察自噬水平下降對(duì)肝星狀細(xì)胞活化水平及Nrf2-keap1-ARE信

2、號(hào)通路活化程度的影響;采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的pEGFP-Nrf2重組質(zhì)粒或合成的siNrf2片段轉(zhuǎn)染入HSC-T6細(xì)胞中,從而過(guò)上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)水平,一方面探討Nrf2過(guò)表達(dá)對(duì)酒精刺激下肝星狀細(xì)胞活化水平的影響,另一方面通過(guò)沉默Nrf2表達(dá)以探討Nrf2在自噬調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化機(jī)制中的地位;分別采用RT-PCR及Western blotting對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化標(biāo)志蛋白α-SMA及I-collagen mRNA及蛋

3、白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)以判斷HSC-T6細(xì)胞活化水平;采用MDC染色、自噬標(biāo)志蛋白LC3II及自噬特異底物P62蛋白表達(dá)檢測(cè)以判斷細(xì)胞自噬水平;采用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖水平以及細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：酒精作用下HSC-T6細(xì)胞活化水平增高,伴有細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高;3-甲基腺嘌呤作用于HSC-T6細(xì)胞后,自噬水平明顯下降且伴有細(xì)胞活化水平下降;3-甲基腺嘌呤作用于HSC-T6細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Nrf2活