基于BEAS-2B細(xì)胞模型的青翹提取物抗炎活性研究.pdf

1、連翹為木犀科植物連翹Forsythia Suspensa(Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)，是中醫(yī)常用傳統(tǒng)中藥。藥典收錄含有連翹的中藥處方有40多種，如雙黃連口服液、銀翹解毒片和芩連片等。中藥連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，用于潰瘍、感染等疾病的治療，如呼吸道感染和丹毒?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，連翹具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肝損傷等功效。連翹酯苷A（FTA）作為連翹的主要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作

2、用。根據(jù)中醫(yī)用藥習(xí)慣，連翹針對(duì)人“上焦”肺系統(tǒng)等疾病的治療有較好的效果，而呼吸道上皮是病原體入侵呼吸系統(tǒng)的首要組織防線(xiàn)，在先天免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。炎癥發(fā)生時(shí)，呼吸道上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子及抗菌肽等免疫因子參與炎性反應(yīng)。為了闡明連翹對(duì)“上焦”呼吸系統(tǒng)疾病治療效果較好的用藥特點(diǎn)，本文以人呼吸道上皮細(xì)胞（BEAS-2B）為模型載體，研究連翹提取物的抗炎活性及其作用機(jī)制。另外，本文還比較了不同產(chǎn)地連翹提取物的抗氧化活性及其對(duì)

3、BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　1.不同產(chǎn)地青翹提取物的體外抗氧化活性研究
　　采用清除DPPH·自由基的方法，對(duì)21個(gè)不同產(chǎn)地的連翹藥材的40％乙醇提取物進(jìn)行體外抗氧化研究，結(jié)果表明連翹提取物均表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性，通過(guò)對(duì)其清除DPPH·自由基IC50的測(cè)定，能顯示不同產(chǎn)地之間的差異，通過(guò)判別分析對(duì)21個(gè)產(chǎn)地提取物的抗氧化活性進(jìn)行有效區(qū)分。
　　2.不同產(chǎn)地青翹提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用<

4、br>　　以金黃色葡萄球菌（過(guò)濾液或滅活的菌體）為致炎物建立 BEAS-2B細(xì)胞損傷模型，考察21個(gè)產(chǎn)地青翹提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分3大組，分別為Control組、Model組、給藥組（安澤等21個(gè)產(chǎn)地連翹藥材40%乙醇提取物）。Control組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；Model組：400μg/mL（濕重）金黃色葡萄球菌致炎物作用細(xì)胞24 h；給藥組：50μg/mL連翹提取物預(yù)處理BEAS-2B細(xì)胞2 h后，再給予400

5、μg/mL（濕重）金黃色葡萄球菌致炎物作用24 h。結(jié)果顯示，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Control組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，Model組局部細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞觸角減少，有變圓的傾向，給藥組能在一定程度上改善這種狀態(tài)；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，Model組與 Control組存在明顯差異，給藥組能對(duì)金黃色葡萄球菌致炎物導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞的損傷起到預(yù)防作用。
　　3.青翹提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞模型的抗炎機(jī)制研究
　　用LPS

6、誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，設(shè)置不同濃度的青翹提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞給予預(yù)防治療，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的分泌情況，考察FSE的抗炎效果；通過(guò)對(duì)IKK-α、p65的磷酸化程度檢測(cè)，可顯示NF-κB信號(hào)通路被活化的情況，進(jìn)而揭示FSE可能的抗炎機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共分13組，分別為Control組、Model組（LPS，1μg/mL）、陽(yáng)性藥組（吲哚美辛、地塞米松，1μM）、90%FTA組（25、50、100μg/mL）、60%FTA組

7、（25、50、100μg/mL）、FSEE組（25、50、100μg/mL）。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明：①鏡檢法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，Model組與 Control組無(wú)明顯差異；②采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中的NO與細(xì)胞內(nèi)的ROS、SOD水平。其中，1μg/mL LPS刺激BEAS-2B細(xì)胞24 h后，模型組NO、ROS釋放量顯著增加；FSE給藥組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的降低NO、ROS含量的作用，90%FTA、60%FTA、FSEE組隨著濃度的增加，降

8、低細(xì)胞內(nèi)NO、ROS含量的效果越明顯，有劑量依賴(lài)關(guān)系。另外，模型組SOD含量顯著降低，90%FTA、60%FTA組在25、50μg/mL時(shí)有預(yù)防作用，F(xiàn)SEE組在50μg/mL時(shí)有預(yù)防作用，其中以90% FTA高濃度時(shí)預(yù)防BEAS-2B細(xì)胞損傷的作用最好；③ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6的水平。LPS刺激24 h后，細(xì)胞上清中IL-6含量顯著增加，F(xiàn)SEE、60%FTA、90%FTA組在25、50、100μg/mL均能抑制LPS誘導(dǎo)

9、的IL-6產(chǎn)生，其中以90%FTA的效果最好；④Q-RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表達(dá)。1μg/mL LPS刺激BEAS-2B細(xì)胞24 h后，模型組IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA的表達(dá)量顯著增加；陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松）IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA的表達(dá)量明顯減少；90%FTA組在25、50、100μg/mL均表現(xiàn)出良好的抑制IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá)的效果；60

10、%FTA組與FSEE組在25、50、100μg/mL能抑制IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)，但不能抑制TNF-αmRNA的表達(dá)。⑤Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中IKK-α、P65蛋白及其磷酸化水平的表達(dá)。正常對(duì)照組中IKK-α、p65的磷酸化程度很低，加入LPS（1μg/mL）刺激后可以導(dǎo)致IKK-α、p65的磷酸化程度明顯升高，這說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路被高度活化。通過(guò)比較p-IKK/IKKα、p-p65/p65，90%FTA、

11、60%FTA、FSEE三種FSE提取物可以不同程度的抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，其中以90%FTA的效果較顯著，Dex與FSEE組效果不顯著。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了90%FTA提取物具有更好的抗內(nèi)毒素作用，其機(jī)制可能與其干擾 LPS-TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
　　通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)，連翹提取物能提高金黃色葡萄球菌致炎物作用的BEAS-2B細(xì)胞的生存率，并能抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞分泌的炎性因子IL-6、IL-