CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA對小鼠免疫細胞功能影響的實驗研究.pdf

1、Toll樣受體(toll-1ike receptor，TLRs)是近來發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，其不同程度地表達于淋巴細胞、白細胞以及包括巨噬細胞和樹突狀細胞在內(nèi)的單核吞噬細胞表面。TLRs能選擇性地識別侵入機體的病原微生物所攜帶的病原相關(guān)分子模式( pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。 CpG-ODN(C

2、pG-oligodexynucleotides)是來自細菌、病毒等病原體基因組的非甲基化核苷酸序列。CpG-ODN和LPS等PAMPs一樣，具有明確的活化天然免疫細胞的功能。人工合成的非甲基化的CpG-ODN可以在體外模擬細菌DNA作用，并主要通過TLRs9而發(fā)揮刺激細胞的作用，而且它可以作為瘤苗的佐劑。乳酸桿菌分泌物RNA作為一種PAMPs，其對免疫細胞的作用、是否也是通過TLRs或TLR9發(fā)揮刺激細胞的作用等都有待深入研究。

3、 目的： 1．CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外刺激小鼠脾細胞、巨噬細胞，樹突狀細胞增殖的影響，及對巨噬細胞吞噬功能的影響。 2．CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外沖激的小鼠樹突狀細胞對YAC-1的殺傷作用及INF-γ分泌的影響。 3．不同處理的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞刺激全脾細胞增殖及對其NF-KB的表達的影響。 4．通過上述實驗比較CpG

4、-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA對免疫細胞功能的影響觀察二者在功能上是否有相似性及比較二者作為瘤苗佐劑功能的相似性。 方法： 1．利用小鼠脾臟來源的DC與巨噬細胞的生物學(xué)特性體外分離兩者，用MTT法測其增殖活性，中性紅吞噬實驗測巨噬細胞的吞噬功能。 2．用IL-4、GM-CSF誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞體外獲取BMDC，用MTT法測其增殖活性；混合淋巴反應(yīng)測其刺激全脾細胞增殖的能力，Western Blot法測不同處理的BM

5、DC NF-κB的表達。 3．CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外分別刺激小鼠樹突狀細胞24小時，收集DC及培養(yǎng)上清，用MTT法測不同處理的DC對YAC-1細胞的殺傷活性，用ELISA法測DC培養(yǎng)上清中INF-γ的濃度。 4．用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果： 1．不同處理對小鼠免疫細胞增殖的變化： ①全脾細胞：CpG-ODN、CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿

6、菌分泌物RNA處理組對全脾細胞有促進增殖的作用，單用瘤苗與乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗處理組對其生長有抑制作用；CpG-ODN處理組與其它各組差異顯著(P<0.05)。 ②巨噬細胞：用不同刺激物處理的脾臟巨噬細胞增殖能力與單純對照之間差異不顯著(P>0.05)。 ③脾臟來源的DC：CpG-ODN處理組和乳酸桿菌分泌物RNA處理組可促進脾臟來源DC增殖，其余各組對其生長有抑制作用；CpG-ODN處理組和乳酸桿菌分泌RNA：理

7、組與單純對照和其他不同處理組的增殖指數(shù)之間差異顯著(P<0.05)，其他組與對照之間差異不顯著(P>0.05)。 ④骨髓來源的DC：用不同刺激物的處理對BMDC生長有抑制作用，各組不同處理對BMDC生長抑制作用差異不顯著(P>0.05)。 2．中性紅吞噬實驗檢測不同處理對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響：不同的處理均可增加巨噬細胞的吞噬能力。各組不同處理的脾臟巨噬細胞吞噬中性紅的能力與單純對照之間差異顯著(P<0.05)，其中

8、以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值較其他處理組高。 3．不同處理的DC對小鼠YAC-1細胞的殺傷作用： ①脾臟來源的DC對小鼠YAC-1細胞的殺傷作用：按效靶比10：1,CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物對YAC-1細胞的殺傷率明顯高于單純對照組(P<0.05)，以CpG-ODN+瘤苗溶解物組的殺傷率最高。其他各組之間差異不顯著(P>0.05)。 ②骨

9、髓來源的DC對小鼠YAC-1細胞的殺傷作用：按效靶比10:1，經(jīng)不同處理的BMDC對小鼠YAC-1細胞的YAC-1細胞殺傷有抑制作用，除CpG-ODN+瘤苗溶解物處理組外，各組對YAC-1細胞的殺傷率與單純對照相比，明顯降低(P<0.05)。 4．不同抗原沖激的DC培養(yǎng)上清中INF-γ的濃度： ①脾臟來源DC培養(yǎng)上清中γ-INF的濃度：單純對照組為211.58±57.16pg/ml，CpG-ODN組為456.00±31.

10、68 pg/ml，瘤苗溶解物組為300.22±53.91 pg/ml，CpG-ODN+瘤苗溶解物組為563.44±36.77 pg/ml，乳酸桿菌分泌物RNA組為388.86±77.26 pg/ml，乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物組為781.00±76.42pg/ml。結(jié)果表明不同處理組與對照相比可促進DC分泌γ-INF，各處理組與對照相比差異顯著(P<0.05)。 ②骨髓來源DC培養(yǎng)上清中γ-INF的濃度：單純對照組為177

11、7.77±57.16 pg/ml，CpG-ODN組為1096.00±48.41 pg/ml，瘤苗溶解物組為1256.70±52.61 pg/ml，CpG-ODN+瘤苗溶解物組為1043.17±41.25 pg/ml，乳酸桿菌分泌物RNA組為1249.98±54.56 pg/ml，乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物組為1313.11±43.91pg/ml。結(jié)果顯示各不同處理組與對照相比可抑制DC分泌INF-γ。 5．混合淋巴反應(yīng)測其

12、刺激全脾細胞增殖的能力：用不同刺激物處理的BMDC均可刺激全脾細胞增殖，以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值較其他處理組高。 6．不同處理的BMDC NF-κB的表達的影響：不同處理組與對照相比表達明顯上調(diào)。 結(jié)論： 本實驗結(jié)果表明CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA對全脾細胞和脾臟來源的DC增殖有促進作用，對BMDC生長有抑制作用；它們不刺激巨噬細胞增殖但可以明顯增強巨噬細胞的