豬源乳酸桿菌的篩選及其對(duì)仔豬腸道黏膜免疫影響的研究.pdf

1、本試驗(yàn)從健康仔豬十二指腸黏膜分離篩選到一株唾液乳酸桿菌(L.sarlivariusB1)，體外試驗(yàn)結(jié)果表明L．sarlivariusB1產(chǎn)酸能力及與上皮細(xì)胞粘附能力均較強(qiáng)．采用新生仔豬為對(duì)象，研究L.sarlivarius B1對(duì)仔豬黏膜免疫的影響及其作用機(jī)制，并以大腸桿菌E coli k88為指示菌感染仔豬，進(jìn)一步研究L.sarlivarius B1抵抗大腸桿菌E coli k88感染的影響．
　　 1．豬源乳酸桿菌的分離與鑒

2、定
　　 首先從四種不同品種的30日齡仔豬（長(zhǎng)白豬、山東菜蕪黑豬、杜洛克豬、貴州巴馬小香豬）十二指腸黏膜分離到36株乳酸桿菌，然后對(duì)36株乳酸桿菌體外產(chǎn)乳酸、在Caco-2細(xì)胞表面的粘附力以及抗生素敏感性進(jìn)行測(cè)定．從中篩選出10株產(chǎn)酸能力和粘附力強(qiáng)的的乳酸桿菌，最后通過PCR-DGGE圖譜技術(shù)對(duì)10株純菌分離株和四個(gè)品種豬的十二指腸黏膜乳酸桿菌進(jìn)行對(duì)比，分析所分離的乳酸桿菌在仔豬十二指腸黏膜分布情況，最后選取其中的4株菌進(jìn)行16

3、S rRNA分子鑒定．結(jié)果表明：36株乳酸桿菌產(chǎn)酸性能力和粘附力存在一定的差別，10株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸桿菌與上皮細(xì)胞的粘附能力均比參考菌株L.brevisl.2028和L．a(chǎn)cidophilus(ATCCA356)強(qiáng)，16S rRNA基因序列分析顯示，所測(cè)4株乳酸桿茵均與唾液乳酸桿唾液亞種(Lactobacillus salivarius subsp,salivarius)同源性高達(dá)98％，部分序列已被Genbank收錄，登錄號(hào)為GQ3

4、03717和GQ303718。選取產(chǎn)酸能力與粘附力最強(qiáng)的L.sarlivariusBl為益生菌候選菌株。2．L．salivarius B1對(duì)仔豬小腸發(fā)育的影響
　　 應(yīng)用篩選出的L.sarlivariusB1飼喂新生仔豬，研究L.sarlivariusBl對(duì)仔豬生產(chǎn)性能和小腸發(fā)育的影響，試驗(yàn)選擇6窩初生重、胎次相近的新生仔豬為研究對(duì)象，分成乳酸桿菌組、對(duì)照組和商品日糧組．乳酸桿菌組分別于仔豬0、7、11、26日齡灌喂L.sali

5、varius B1（菌液離心后用蔗糖溶液調(diào)至活菌數(shù)為5×109cfu/ml），對(duì)照組則飼喂同體積的蔗糖溶液，乳酸桿菌組和對(duì)照組仔豬均從7日齡開始飼喂無抗開食料，商品日糧組則飼喂商品仔豬料。28日齡稱重后每窩隨機(jī)選擇2頭仔豬宰殺，隨后取小腸固定，制作組織切片、染色．測(cè)定腸絨毛高度和腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和lea分泌細(xì)胞數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)果顯示：L salivarius B1能夠顯著地提高仔豬小腸IEL數(shù)量(p<0.05)和lea分泌細(xì)胞的面積(p<

6、0.01)；L，salivariusBl還能提高仔豬日增重(p<0.05)和小腸絨毛高度(p<0.05)。3．L．salivarius B1在仔豬腸道的定植情況及其對(duì)腸道菌群的影響
　　 L．salivarius B1飼喂新生仔豬后能夠促進(jìn)小腸發(fā)育和增加腸道免疫細(xì)胞數(shù)量。為進(jìn)一步研究L．salivariusBl在體內(nèi)的作用機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)L．salivariusB1飼喂后在仔豬體內(nèi)的定植及對(duì)腸道菌群組成的影響進(jìn)行了研究。給新生仔豬

7、飼喂L．salivariusBl后分別于7、14、21日齡采取仔豬新鮮糞便，28日齡每窩隨機(jī)挑選2頭（每組4頭）仔豬宰殺，取腸黏膜。采用DGGE方法分析L.salivarius Bl在體內(nèi)的定植情況，利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)腸黏膜中L.salivarius數(shù)量進(jìn)行分析；用傳統(tǒng)的活菌計(jì)數(shù)方法對(duì)幾種主要的腸道菌計(jì)數(shù)．結(jié)果表明：L.salivarius能夠在仔豬哺乳后期自然出現(xiàn)；DGGE圖譜顯示飼喂L salivarius B1的

8、7日齡仔豬糞便中出現(xiàn)該菌株相應(yīng)的條帶；在飼喂L，salivariusBl的28日齡仔豬腸黏膜中，L．salivarius總數(shù)顯著高于其它組(p<0.05)；7日齡的仔豬糞便和28日齡仔豬腸黏膜中雙歧桿菌數(shù)量為乳酸桿菌組明顯高于對(duì)照組(p<0.05)；但對(duì)大腸桿菌和腸球菌等腸道菌數(shù)量沒有明顯的影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明L.salivarius Bl飼喂新生仔豬后能夠有效地定植于仔豬體內(nèi)，并且能夠增加哺乳前期仔豬糞便和十二指腸局部黏膜雙歧桿菌的數(shù)

9、量。4．L.salivariusBl早期定植對(duì)仔豬腸道β-防御素2和細(xì)胞因子分泌的影響
　　 新生仔豬腸道細(xì)胞能夠分泌抗茵肽參與天然免疫反應(yīng)，β-防御素(pBD-2)是抗菌肽中重要的一種，在仔豬先天性免疫中起著非常重要的作用。給新生仔豬飼喂L．salivariusBl后于7、14、21、28日齡采取仔豬唾液，28日齡每窩隨機(jī)挑選2頭（每組4頭）仔豬宰殺取黏膜。應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)腸黏膜中pBD-2及細(xì)胞因子IL

10、-1β、TNF-α和IL-6基因的表達(dá)水平，用ELISA方法對(duì)不同日齡仔豬唾液中的pBD-2含量進(jìn)行測(cè)定．結(jié)果顯示：L salivarius B1早期定植能使十二指腸黏膜pBD-2基因表達(dá)水平及含量顯著升高(p<0.01)；仔豬唾液中pBD-2的含量隨日齡有不同程度的增加，其中在14，28日齡時(shí)乳酸桿菌組仔豬唾液中的pBD-2含量極顯著增加(p<0.05)。L salivariusBl早期定植還對(duì)回腸IL-6基因表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用(p

11、<0.05)．本試驗(yàn)的結(jié)果表明L．salivarius B1早期定植能夠促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞功能基因的表達(dá)，提高小腸局部黏膜免疫的防御水平。5．L.salivariusBl早期定植對(duì)腸道TLR表達(dá)的影響
　　 Toll樣受體(TLRs)是一類主要表達(dá)于天然免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體，通過識(shí)別與結(jié)合相應(yīng)的配體啟動(dòng)宿主天然抗感染免疫。目前，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在12種TLRs，TLR2主要對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分進(jìn)行識(shí)別，而TLR9主

12、要識(shí)別細(xì)菌DNA中非甲基化的CpG基序。本試驗(yàn)主要從基因和蛋白水平研究L.salivariusB1對(duì)仔豬小腸TLR2和TLR9表達(dá)水平的影響。給新生仔豬飼喂L.salivariusB1后，28日齡每組隨機(jī)挑選4頭仔豬宰殺取腸黏膜，分別應(yīng)用Real-time PCR方法和Western-Blot方法測(cè)定十二指腸和回腸中TLR2和TLR9的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平．試驗(yàn)結(jié)果顯示： L.salivariusBl能夠顯著地增強(qiáng)十二指腸和回腸中

13、的TLR2的基因和蛋白表達(dá)(p<0.05)，而對(duì)TLR9表達(dá)基因和蛋白水平均無明顯的影響。6．L．salivarius B1對(duì)仔豬抵抗E.coli K88感染的影響
　　 為進(jìn)一步探導(dǎo)L．safivarius B1定植后對(duì)腸道病原菌的抗感染作用，本試驗(yàn)研究了L.safivariusB1對(duì)仔豬抵抗E.coil K88感染的影響．對(duì)前期試驗(yàn)中三組仔豬宰殺后余下的仔豬28日齡斷奶后的腹瀉情況觀察一周，35日齡時(shí)所有仔豬接種相同劑量的大

14、腸桿菌菌液（E.coli K88，活菌數(shù)為10Scfu/ml，接種量為2mL/只），觀察仔豬對(duì)E coli K88感染的抵抗能力，并對(duì)仔豬腸黏膜受損情況及細(xì)胞因子IL-6、TNF-a和IL-lB基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定．結(jié)果表明：早期接種L．salivarius B1的仔豬腹瀉指數(shù)明顯低于對(duì)照組(p<0.05)且康復(fù)較快；腸黏膜的IL-6比未接種L，salivarius B1的仔豬高(p<0.05)，而炎性因子TNF-a則較低(p<0.05)；