脂肪細胞特異性核酸適配體的篩選、分子識別及應(yīng)用初探.pdf

1、第一部分建立針對3T3-L1脂肪細胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)
　　目的：本研究建立3T3-L1脂肪細胞分化模型,采用細胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,cell-SELEX)針對分化成熟的3T3-L1脂肪細胞進行文庫篩選,并獲得能識別脂肪細胞表面膜結(jié)構(gòu)的核酸適配體(Aptamer)。
　　方法：設(shè)計并合成隨

2、機序列DNA文庫,分別用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)及生物素biotin標(biāo)記引物。將3T3-L1前脂肪細胞通過雞尾酒方法誘導(dǎo)脂肪細胞分化,選用分化成熟的3T3-L1細胞作為正篩選細胞,而未分化的前體3T3-L1及HepG2作為負細胞,將文庫與正負細胞反復(fù)孵育進行篩選,與正細胞結(jié)合文庫采用聚合酶鏈法擴增并用作下輪篩選及鑒定。使用流式細胞技術(shù)對文庫的富集程度進行監(jiān)測,鑒定。采用454測序方

3、法對富集文庫進行測序,合成相關(guān)序列并通過流式細胞術(shù)進行鑒定。
　　結(jié)果：使用傳統(tǒng)的雞尾酒方法成功建立了脂肪細胞分化模型,通過應(yīng)用cell-SELEX對分化成熟的脂肪細胞展開篩選,經(jīng)過19輪正負篩選成功富集到針對分化成熟3T3-L1脂肪細胞的ssDNA文庫,經(jīng)過測序分析發(fā)現(xiàn)了4條核酸適體與該脂肪細胞有結(jié)合,分別命名為Adipo-2,Adipo-4,Adipo-5及Adipo-8.
　　結(jié)論：通過CELL-SELEX技術(shù)針對脂肪

4、細胞進行篩選,可以獲得與靶細胞高親和性的核酸適配體。
　　第二部分脂肪細胞相關(guān)棱酸適配體及其功能研究
　　目的：在第一部分實驗的基礎(chǔ)上對篩選出針對脂肪細胞表面的核酸適配體進行特異性分析、解離常數(shù)測定及不同條件對其結(jié)合性能的影響,以進一步了解所篩選的核酸適配體的結(jié)合特性。
　　方法：合成篩選的核酸適配體,與不同系統(tǒng)來源的細胞進行結(jié)合試驗,采用流式細胞術(shù)對其結(jié)合性能進行鑒定;將核酸適體稀釋成不同濃度后與分化成熟3T3-L1

5、脂肪細胞進行孵育,使用流式細胞儀檢測不同濃度核酸適體的結(jié)合能力,并計算各核酸適體的解離常數(shù);采用流式細胞術(shù)檢測了核酸適體在不同溫度孵育,胰島素刺激靶細胞及核酸適體不同截短方案對其結(jié)合性能影響。
　　結(jié)果：核酸適體Adipo1和Adipo8均能與脂肪細胞結(jié)合,而對其它系統(tǒng)來源的細胞幾乎沒有結(jié)合性能。解離常數(shù)測定提示Adipo8,Adipo-1能與脂肪細胞高親和力、高特異性結(jié)合,所測Kd值分別為17.5±5.1 nM和97.5±13.

6、5 nM。4℃和37℃孵育條件對所測核酸適體的結(jié)合沒有影響。Adipo8與分化成熟脂肪的3T3-L1脂肪細胞的結(jié)合能被trpsin及。Protienase K消化液消化,而Adipo1則不受影響。經(jīng)過500nM胰島素處理對Adipo1和Adipo8與分化成熟的脂肪細胞的結(jié)合幾乎沒有影響。
　　結(jié)論：核酸適配體Adipo8對分化成熟的脂肪細胞顯示出良好的結(jié)合性及高度特異性,Adipo8可能的靶標(biāo)為脂肪細胞表面某種與胰島素作用不相關(guān)的

7、膜蛋白,但具體機制有待進一步研究。
　　第三部分脂肪細胞核酸適配體的特異性分子識別及應(yīng)用初探
　　目的：前述細胞實驗表明,核酸適體Adipo8在體外顯示出針對3T3-L1脂肪細胞的結(jié)合特異性,本部分實驗通過大鼠冰凍組織切片進一步證實其特異性,探討使用該核酸適配體用于監(jiān)測脂肪細胞分化程度,流式分選分化成熟脂肪細胞及體內(nèi)應(yīng)用。
　　方法：雄性SD大鼠頸椎脫位法處死后,取附睪脂肪組織,肝臟骨骼肌及胰腺組織制成石蠟切片或直接冰

8、凍切片。冰凍切片時,取上述新鮮組織用OCT包埋置于-20℃低溫恒溫器迅速冷凍后,切成10μm薄片,貼片后用4℃預(yù)冷的丙酮室溫下固定15 min,用PBS洗后采用H&E染色及疫光核酸適配體染色。染色切片置于熒光顯微鏡下觀察,比較兩種方法處理組織時核酸適體對其結(jié)合情況;通過流式細胞術(shù)檢測核酸適配體及對照文庫對不同分化階段的脂肪細胞的結(jié)合程度,探討兩者相對熒光強度與分化時間的相關(guān)性,采用流式細胞儀對與核酸適配體結(jié)合部分的脂肪細胞進行分選;將核

9、酸適配體用cy5標(biāo)記后將其經(jīng)尾靜脈注射入SD大老鼠,生理鹽水灌注后取不同組織進行熒光檢測以確定核酸適體的靶向性。
　　結(jié)果：核酸適配體Adipo-8與S-D大鼠冰凍附睪脂肪組織切片孵育后顯示出很強的熒光信號,而冰凍肝臟,骨骼肌,胰腺組織與核酸適配體孵育后無熒光信號。對照核酸適體文庫與大鼠冰凍附睪脂肪組織孵育未觀察到熒光信號。核酸適體Adipo-8與對照文庫的相對熒光強度與脂肪細胞分化時間呈正相關(guān)。Adipo-8經(jīng)尾靜脈注射到活體大