大腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的間質(zhì)差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、目的：大腸癌肝轉(zhuǎn)移在全世界有著很高的發(fā)病率和病死率。目前越來(lái)越多的研究關(guān)注間質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，間質(zhì)中出現(xiàn)的一些分子標(biāo)志物對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測(cè)和指導(dǎo)靶向治療有著重要的作用，對(duì)大腸癌間質(zhì)分子標(biāo)志物的研究，能更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)大腸癌肝轉(zhuǎn)移，并為實(shí)現(xiàn)最佳的靶向治療奠定基礎(chǔ)。激光捕獲顯微切割和基因芯片兩種新興技術(shù)已成為腫瘤研究的重要手段。前者能在顯微鏡直視下通過(guò)激光捕獲和顯微切割從異質(zhì)性組織中得到目的細(xì)胞或細(xì)胞群，保證了組織的同質(zhì)性；后

2、者可同時(shí)高效率檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因，是篩選差異表達(dá)基因有力的工具。
　　本研究結(jié)合以上兩種技術(shù)，首先用激光捕獲顯微切割技術(shù)純化大腸癌伴或不伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)組織，然后采用Agilent Human4*44K2.0基因芯片構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)的基因表達(dá)譜，以不伴肝轉(zhuǎn)移的大腸癌癌灶間質(zhì)為對(duì)照，采用多種生物信息學(xué)方法篩選大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)相關(guān)基因。
　　方法：收集大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶各4例，利用激光捕獲微切

3、割技術(shù)分離出間質(zhì)組織，提取間質(zhì)組織的總RNA，利用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，對(duì)質(zhì)檢合格的 RNA行線性擴(kuò)增及Cy3單色熒光法標(biāo)記染色后，采用Agilent Nanodrop ND-1000鑒定cRNA產(chǎn)量和純度及評(píng)估其熒光標(biāo)記效率，對(duì)質(zhì)檢合格的cRNA，在適當(dāng)條件下與Agilent Human4*44K2.0基因芯片進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)過(guò)洗滌和掃描后，以GeneSpring GX v11.51軟件對(duì)Cy3進(jìn)行Normalize標(biāo)準(zhǔn)化

4、處理，進(jìn)一步進(jìn)行計(jì)算機(jī)軟件分析，最后得到篩選結(jié)果。
　　利用qRT-PCR對(duì)顯著上調(diào)及下調(diào)的前2位基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：依fold change實(shí)驗(yàn)組（大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)組織）/對(duì)照組（無(wú)轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)組織）>2.0或<0.5的數(shù)據(jù)項(xiàng)，在4例新鮮標(biāo)本的芯片雜交檢測(cè)中共篩選出1948條基因發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)的有1266條，下調(diào)的有682條，將這些基因按 GO（gene ontology）分子功能（Molecul

5、ar function）進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因與細(xì)胞分化、酶活性調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)等有關(guān)。按Pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、局部粘附、細(xì)胞粘附分子、抗原過(guò)程和呈遞、細(xì)胞因子間相互作用、TGF-β信號(hào)通路等通路。
　　RT-PCR驗(yàn)證4條基因，顯示其表達(dá)方向與芯片檢測(cè)一致，符合預(yù)期結(jié)果。
　　結(jié)論：1.結(jié)合激光捕獲顯微切割和基因芯片兩個(gè)技術(shù)成功構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)的相