結(jié)腸癌特異性噬菌體多肽篩選與鑒定的初步研究.pdf

1、結(jié)腸癌是一種嚴重危害公眾健康的常見惡性腫瘤。其病因尚未完全清楚，目前認為是環(huán)境因素與遺傳岡素綜合作用的結(jié)果。其發(fā)病率以北美洲最高，約24-34/10萬；在中國，東南沿海明顯高于北方。近20多年來，世界大多數(shù)國家結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢；由于飲食結(jié)構(gòu)的西化，中國結(jié)腸癌發(fā)病率的上升趨勢也十分明顯。而且，結(jié)腸癌的中位發(fā)病年齡在我國比歐美提前約十年，年輕人患病比歐美多見。結(jié)腸癌的起病隱匿，早期癥狀多不明顯，易被忽視，從而影響了早期診斷。臨床上，不

2、少病人在明確診斷后已經(jīng)失去了根治機會。由于早期診斷的困難，目前結(jié)腸癌的手術(shù)治療以改善全身狀態(tài)的姑息性手術(shù)為主；放療的損傷和化療的不敏感也限制了其療效，而免疫治療對結(jié)腸癌的療效尚未明確。目前，尋找結(jié)腸癌新的特異性結(jié)合配體的嘗試為其有效的診斷和治療提供了希望。 本研究利用人結(jié)腸癌細胞系HT-29，對兩種噬菌體展示的隨機多肽文庫(fLJSE5/6-mer)和fIJSE5/15-met)進行了親和篩選。之所以采取全細胞直接篩選的策略

3、，是因為這種篩選方法與傳統(tǒng)的純化靶分子篩選相比，其作用方式更加接近天然的生物學狀態(tài)，是一個不加選擇壓力的隨機篩選過程，因此尤其適合于篩選諸如腫瘤細胞這樣表面復雜度高、變異性強的細胞。為了篩選出與HT-29結(jié)合的高親和力特異性噬菌體多肽，本研究將篩選條件進行了優(yōu)化。在第一輪篩選中，選用了10<'7>以上的細胞數(shù)量和不嚴格的洗滌條件，以避免低含量的特異性克隆因強洗滌而丟失。待擴增之后，在后兩輪的篩選過程中逐漸降低細胞數(shù)量，并增加洗滌次數(shù)，力

4、爭得到高親和力的特異性噬菌體多肽。經(jīng)過三輪“吸附一洗脫一擴增”的篩選過程，可以看出，從腫瘤細胞上洗脫下來的噬菌體滴度呈現(xiàn)出明顯增加的趨勢。在兩種不同的多肽文庫中，噬菌體滴度從第一輪到第三輪分別增加了208倍和1250倍，說明特異性的噬菌體多肽得到了富集。進一步細胞結(jié)合實驗的鑒定結(jié)果也證明了這個結(jié)論。而且，經(jīng)過反復的實驗未檢測到被細胞內(nèi)吞的噬菌體多肽克隆。隨后從三輪篩選的兩個次級庫中分別挑取了 50 個 單克隆，細胞結(jié)合實驗證實這些克隆均

5、能不同程度地與HT-29結(jié)合。 為了進一步說明這些單克隆是否具有與結(jié)腸癌細胞結(jié)合的腫瘤特異性，首先進行了細胞水平的鑒定。由丁缺乏正常結(jié)腸的細胞系，因此利用同為消化道上皮起源的人肝臟正常上皮細胞L-02作為對照。本研究用了兩種策略來驗證多肽克隆在細胞水平的腫瘤特異性：一是直接鑒定，即直接通過細胞結(jié)合實驗篩選出與HT-29結(jié)合而不與L-02結(jié)合的克?。憾窍蓉摵Y再鑒定，即首先利用L-02進行消減篩選，選取在篩選中不與L-02結(jié)合

6、的次級庫，再挑取單克隆，分別與HT-29和L-02做細胞結(jié)合實驗。通過第一種方法，從與HT一29結(jié)合能力較強的克隆中直接鑒定出了某些6肽和15肽克隆不與L-02結(jié)合。利用負篩的方法，也得到了一些與HT-29結(jié)合而不與L-02結(jié)合的克隆。由于HT-29 是惡性程度較低的未轉(zhuǎn)移腫瘤，為了考查這些克隆是否能結(jié)合惡性程度不同的結(jié)腸癌細胞系，本研究還選取了惡性程度較高的SW-480和轉(zhuǎn)移性腫瘤LOVO做細胞結(jié)合實驗。結(jié)果表明，在以上得到的

7、克隆中有相當一部分克隆可以結(jié)合惡性程度不同的結(jié)腸癌細胞系。隨后，對得到的這些克隆進行測序，但是測序結(jié)果未能對多肽的氨基酸組成給出具體的信息。綜合各種實驗結(jié)果，提示存在空間構(gòu)象影響測序的可能性。為了在組織水平對這些噬菌體多肽克隆的結(jié)腸癌細胞的腫瘤特異性進行評價，本研究用獲得的噬菌體多肽克隆做了免疫組化染色，篩選出了能夠結(jié)合結(jié)腸癌組織而不結(jié)合對應癌旁組織的噬菌體多肽克隆15mer19c。在此基礎(chǔ)上，進一步選取了30對結(jié)腸癌和癌旁——對應的臨

8、床組織標本的石蠟切片擴大樣本量，結(jié)果表明15mer19C克隆不與任何一例正常組織結(jié)合，且可以較為有效地區(qū)別其中17例結(jié)腸癌和對應的癌旁組織標本。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)這一克隆在同為消化道惡性腺上皮起源的胃癌組織中存在一些交叉反應，這表明其結(jié)腸癌的特異性是相對的。為了考查15mer19C克隆是否會在機體內(nèi)與其它的正常組織結(jié)合，本研究利用小鼠體內(nèi)實驗檢測了該克隆在體內(nèi)的生物學分布。將1.2×10<'10>TU的噬菌體多肽15merl9C從尾靜脈

9、注入小鼠，測定不同臟器的噬菌體滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體滴度最高的器官是腦和大腸，最多也只有8.0×10<'4>/ml.g。這就表明在體內(nèi)噬菌體多肽克隆15mer19C幾乎不與其它正常組織結(jié)合。計劃下一步將該克隆表達進行氨基酸測序，并利用結(jié)腸癌腫瘤模型考查其在體內(nèi)的腫瘤靶向性。 本研究應用噬菌體展示隨機多肽文庫，用完整的人結(jié)腸癌細胞系HT-29作為篩選的靶分子，采用正常篩選和負篩選的方法，成功地篩選出了與不同惡性程度的人結(jié)腸癌細胞