轉(zhuǎn)移性大腸癌癌旁組織中microRNA表達譜的研究.pdf

1、目的： 大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國最常見的惡性腫瘤中排名第五，且近年來發(fā)病率居高不下并呈上升趨勢。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移率高低與患者預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者，其術(shù)后5年生存率可達91％，而對于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的患者，其術(shù)后5年生存率可低至10％以下。因此，進一步研究發(fā)現(xiàn)與大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志及其作用機制并對其深入研究，無疑對大腸癌的早期診斷和治療

2、有著極為重大的意義。microRNA(miRNA)是一類長度為19-25個核苷酸左右的非編碼單鏈小RNA分子，其參與調(diào)節(jié)了生物體生命過程中一系列的重要進程，包括細胞增殖、分化和凋亡。目前認為miRNA主要是通過與靶mRNA的部分區(qū)域主要是3’-非翻譯區(qū)的序列互補結(jié)合，從而抑制mRNA翻譯或?qū)е耺RNA降解進而調(diào)節(jié)目的基因表達的。在人體內(nèi)，miRNA的異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近幾年來，人們相繼在血液系腫瘤及許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)了一系

3、列miRNA的異常表達。miRNA表達譜芯片是一種高通量，快速地檢測miRNA表達量的手段，目前已有研究利用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些與大腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的miRNA。本研究利用miRNA表達譜芯片比較大腸癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移患者之間癌旁組織miRNA表達的差異，從癌周微環(huán)境角度探討大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機制及與其相關(guān)miRNA標(biāo)記物。 方法： 1.收集2007年10月至2008年1月間溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌癌

4、旁組織標(biāo)本共6例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者3例，設(shè)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者3例，設(shè)為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及其他針對腫瘤的特殊治療。術(shù)后病理診斷證實均為大腸癌。 2.抽提組織總RNA，將Cy3熒光標(biāo)記的miRNA與含有723個人類miRNA探針的Aglient表達譜芯片雜交反應(yīng)。雜交后的芯片使用Agilent microarray熒光掃描儀進行圖象掃描，采用Agilent Feature Extractio

5、n軟件進行數(shù)據(jù)分析，找出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組兩組癌旁組織間差異表達的miRNA。利用miRNA表達譜芯片技術(shù)來對比分析大腸癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移患者之間癌旁組織miRNA表達的差異。 3.為了進一步驗證芯片結(jié)果的可靠性，利用Qiagen公司的miScript SYBR Green PCR試劑盒，以U6作為內(nèi)參照，對差異表達的miRNA分子進行實時定量PCR驗證。使用Applied Biosystem公司的7300定量PCR

6、儀進行檢測。 結(jié)果： 1.各組織的總RNA提取結(jié)果良好，總RNA的吸光度OD260/OD280值均介于1.8-2.2之間，電泳結(jié)果證實提取到的RNA完整性好，無降解及污染現(xiàn)象。 2.miRNA在兩組癌旁組織間的差異性表達 通過比較大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組癌旁組織之間的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)兩個miRNA出現(xiàn)差異表達，分別為hsa-miR-129*(P=0.018)與hsa-miR-137(P=0

7、.043)。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，這兩個miRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的癌旁組織中表達明顯上調(diào)。 3.差異表達miRNA的實時熒光定量PCR驗證 選擇hsa-miR-137在6例大腸癌患者的癌旁組織中進行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，hsa-miR-137在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的癌旁組織中表達顯著上調(diào)，且兩組表達水平差異達到6.6倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)。hsa-miR-137的實時熒光定量PCR結(jié)

8、果與芯片結(jié)果完全相符。 結(jié)論： 我們在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌癌旁組織的miRNA表達譜比較中發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNA，找到了兩個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA，分別是hsa-miR-129*和hsa-miR-137。這兩個差異表達的miRNA將來可能會給臨床上判斷和預(yù)測大腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供更為有效和準(zhǔn)確的分子學(xué)依據(jù)，同時對臨床醫(yī)師在治療方案的選擇上可能會起著指導(dǎo)作用。另外，這些miRNA可以通過各