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1、目的構(gòu)建表達(dá)白細(xì)胞介素-18的條件增殖腺病毒ZD-IL-18并研究其介導(dǎo)IL-18對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的抗腫瘤活性。 方法以質(zhì)粒pJW-IL-18為模板，PCR擴(kuò)增獲得編碼成熟IL-18的基因序列。將IL-18基因克隆至pCA13質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCA13-IL-18。用限制性內(nèi)切酶Bgl II從pCA13-IL-18酶切出包含CMV啟動子及IL-18基因的表達(dá)框，并克隆至條件增殖腺病毒質(zhì)粒pZD55，構(gòu)建重組質(zhì)粒pZD
2、55-IL-18。將pZD55-IL-18與含有腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，9～12天后出現(xiàn)病毒空斑。提取重組腺病毒的DNA，經(jīng)PCR鑒定正確者即為條件增殖腺病毒ZD55-IL-18。重組腺病毒大量擴(kuò)增，氯化銫梯度離心純化，測定病毒滴度。ZD55-IL-18轉(zhuǎn)染人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞，通過MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖抑制及結(jié)晶紫染色法分析細(xì)胞病變作用，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-18 mRNA
3、的表達(dá)及免疫印跡法(Western Blotting)分析E1A與IL-18的表達(dá)。 結(jié)果成功構(gòu)建了表達(dá)IL-18的條件增殖腺病毒ZD55-IL-18；經(jīng)PCR鑒定表明ZD55-IL-18包含目的基因；ZD55-IL-18的滴度可達(dá)1×1011PFU/ml；Western Blotting的結(jié)果顯示ZD55-IL-18在A375腫瘤細(xì)胞中表達(dá)E1A與IL-18；ZD55-IL-18抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375生長的作用顯著優(yōu)于
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