人白細胞介素23基因克隆和攜帶EGFP腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、膽管癌是一種高度惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。多數(shù)膽管癌患者在就診時已是中晚期，僅有10﹪的患者能接受手術(shù)治療，但手術(shù)切除后的遠期效果亦不樂觀。文獻報告，歐美國家膽管癌術(shù)后5年生存率僅為5﹪，13﹪。許多學者在深入進行膽管癌基礎研究，不斷改進手術(shù)方法的同時，積極探索膽管癌的各種綜合治療措施。其中基因免疫治療被認為是繼手術(shù)、放療、化療后的第四大腫瘤治療模式而備受關(guān)注。 膽管癌和其他腫瘤一樣，復發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因在于機體對腫瘤免

2、疫防預能力的缺失，即腫瘤的免疫逃避機制，而免疫逃避的核心在于機體缺乏對腫瘤抗原的有效遞呈并誘導特異性抗腫瘤免疫反應。腫瘤細胞多為弱免疫原性，缺乏主要組織相容性復合體分子、共刺激和粘附分子，因此難以激活機體的抗腫瘤免疫應答。近年來，免疫抗腫瘤研究最突出的進展之一是對機體內(nèi)抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells,APC)的認識，其中樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)是目前己知的體內(nèi)功能最強大的專職抗原

3、遞呈細胞，是機體免疫應答的激發(fā)者，其最大的特點是既能刺激體內(nèi)初始型T細胞增殖，又能有效地刺激宿主再次應答，被稱為機體免疫系統(tǒng)的“哨兵”。而IL-23作為一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，可增強DC在腫瘤環(huán)境中的生存力和對腫瘤抗原肽的遞呈作用；IL-23還可促進活化的T細胞和記憶性T細胞增殖；誘導活化T細胞和DC產(chǎn)IFN-γ、IL-12等Th1型細胞因子，這類細胞因子是介導抗腫瘤細胞免疫的主要因素。已有動物實驗證實，IL-23自身有顯著抗腫瘤作用。L

4、D等用編碼單鏈IL-23(SCIL-23)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸腺癌細胞系CT26(CT26/scIL-23)，大多數(shù)的荷瘤小鼠腫瘤消退，70﹪的小鼠能完全排斥腫瘤細胞的再沖擊。 Wang等用表達P19和P40的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染結(jié)腸未分化腺癌細胞colon26(colon26/IL-23)，發(fā)現(xiàn)在有免疫活性的小鼠中，colon26瘤生長明顯被抑制，隨后消失。由此可見IL-23是一種潛在的抗腫瘤免疫佐劑，IL-23基因可成為

5、抗腫瘤基因治療的候選基因。 保證IL-23基因在DC中持久高效表達，選擇合適的轉(zhuǎn)運載體十分重要。腺病毒載體是常用的基因轉(zhuǎn)移載體，它具有轉(zhuǎn)染效率高(分裂期與非分裂期細胞均可感染)；插入外源基因片段長；不整合入宿主細胞基因組；對機體毒性小等優(yōu)點而被廣泛用于基因治療研究。 本試驗擬克隆人白介素23雙亞基因P19和P40，利用Admax法構(gòu)建攜帶hIL-23的復制缺陷型腺病毒載體，同時為了監(jiān)控外源基因的表達，我們引入增強型綠

6、色熒光蛋白(EGFP)，研究hII-23在DC中的表達及對。DC抗原遞呈作用的影響，為進一步轉(zhuǎn)染DC及膽管癌細胞提供理論和實驗根據(jù)。 目的：分別克隆人IL-23基因的雙亞基P19cDNA和P40cDNA， 構(gòu)建含人IL-23基因的復制缺陷型腺病毒載體，為轉(zhuǎn)染DC細胞和構(gòu)建DC疫苗及其介導的治療提供基礎。 方法：設計P19探針，從人骨髓細胞cDNA文庫獲得1個陽性克??；從人白血病細胞K562總RNA中提取P40總RN

7、A，RT-PCR法擴增P19和P40基因，酶切及測序鑒定。P19、P40及EGFP經(jīng)IRES序列相連，片斷回收后經(jīng)酶切定向插入腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC-316 載體，獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-mCMV-P19-IRES-P40-GEFP。通過酶切、PCR．對插入片斷測序鑒定后，將該重組質(zhì)粒和骨架腺病毒載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，利用．AdMax系統(tǒng)進行腺病毒包裝，通過觀察EGFP的表達及PCR對腺病毒載體進行鑒定，利用EGFP及TCI

8、D50法進行病毒滴度及感染力分析。 結(jié)果：P19和P40基因經(jīng)測序和GENEBANK中序列完全一致，構(gòu)建的PDC-316-P19-IRES-P40-GEFP經(jīng)酶切得到1387bP的P19-IRES-P40片斷。經(jīng)轉(zhuǎn)染包裝，3天即見綠色熒光蛋白的表達，11天可見噬斑出現(xiàn)。電鏡下可見在293細胞中病毒顆粒形成，雙引物酶切鑒定，可擴增出特異性片段，而對照ade-EGFP則不能擴出目的基因片段。成功構(gòu)建了含人IL-23和EGFP的腺病