肺炎嗜衣原體Cpn0425重組蛋白的克隆表達及誘導THP-1細胞產(chǎn)生前炎癥細胞因子和凋亡的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中進行誘導表達,純化獲得重組融合蛋白Cpn0425。研究該重組蛋白在體外誘導人單核細胞產(chǎn)生前炎癥細胞因子 IL-8和IL-1β的水平及誘導細胞凋亡的作用,為進一步探索 Cpn感染致病的分子機制提供試驗依據(jù)。
　　方法:PCR擴增肺炎嗜衣原體 Cpn0425蛋白編碼基因,構(gòu)建pGEX6p-2/Cpn0425重組質(zhì)粒,測序正確后在 E.coli BL21中誘導

2、表達,用SDS-PAGE和Western-Blot進行分析和鑒定。用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)瓊脂糖凝膠FF純化重組蛋白,A280紫外分光光度法測定純化蛋白濃度,用鱟試驗法檢測純化后蛋白的內(nèi)毒素。用ToxinEraser純化柱去除內(nèi)毒素后用不同濃度的GST-Cpn0425刺激THP-1細胞;ELISA法檢測經(jīng)刺激后的THP-1細胞產(chǎn)生的IL-8和IL-1β水平;以WST-1法檢測經(jīng)G

3、ST-Cpn0425處理后THP-1細胞的增生或抑制作用;用Hoechst33258熒光染色、DNA片段化分析、AnnexinV-FITC-PI染色法檢測細胞凋亡情況。
　　結(jié)果:構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表達出Mr約為50kDa的GST-Cpn0425目的蛋白,超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細胞內(nèi)以可溶性形式表達,經(jīng)采用默克Novagen的GST純化樹脂純化獲

4、得純度在95％以上的重組蛋白。GST-Cpn0425能誘導THP-1細胞表達IL-8和IL-1β,并以時間、劑量依賴方式刺激細胞分泌前炎癥細胞因子IL-8和IL-1β,當 GST-Cpn0425的濃度為6μg/mL時產(chǎn)生的IL-8量最多,為(716.11±41.26)pg/mL當GST-Cpn0425的濃度為8μg/mL時產(chǎn)生的IL-1β量最多,為(32.91±5.49)pg/mL;當GST-Cpn0425刺激THP-1細胞24h時產(chǎn)生

5、的IL-8和IL-1β量則達到高峰。另外GST-Cpn0425以劑量依賴方式抑制THP-1細胞增殖;當12μg/mL GST-Cpn處理THP-1細胞48h后,形態(tài)學上,細胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細胞起泡及凋亡小體等凋亡特征。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆Cpn0425基因并構(gòu)建了pGEX6p-2/Cpn0425原核表達載體,將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21后能高效表達出一相對分子質(zhì)量約50kDa的GST-Cpn0425融合蛋