沙眼衣原體感染誘導炎癥機制的研究.pdf

1、研究目的： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，C.trachomatis)感染除導致沙眼外，也可以引起性傳播疾病，導致宮頸炎、輸卵管炎、盆腔炎等，最終可致流產(chǎn)、異位妊娠、不孕等嚴重后遺癥。目前認為C.trachomatis感染引起的炎癥反應是其致病的主要原因，但確切機制尚不明確，本課題從①C.trachomatis感染引起IL-1α、IL-6、IL-8等炎癥因子產(chǎn)生的分子機制；②IL-1α在C.tracho

2、matis誘導IL-8產(chǎn)生中的作用；以及③caspase-1在宿主抵抗衣原體感染和衣原體導致病理損傷中的作用，三個方面探索C.trachomatis感染誘導炎癥的機制。為深入研究C.trachomatis致病機制和機體的抗感染免疫反應提供實驗依據(jù)。 研究方法： 1.用ELISA、RT-PCR方法檢測C.trachomatis感染誘導上皮細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8等細胞因子的產(chǎn)生；用免疫熒光技術觀察C

3、trachomatis感染后細胞內(nèi)IL-8的表達和亞細胞定位。 2.用免疫印跡法檢測C.trachomatis感染后ERK、P38、JNK三條MAPK信號通路的激活，用化學抑制劑分別抑制三條通路的活化，觀察各條通路在Ctrachomatis誘導IL-1α、IL-6、IL-8等細胞因子中的作用。 3.用IL-1α siRNA、IL-1α-1-鼠巨噬細胞感染實驗以及對IL-1α不同表達能力的細胞系感染實驗，觀察IL-α在C.

4、trachomatis誘導IL-8中的作用。 4.通過IL-1Ra和IL-1α中和性抗體阻礙IL-1R I受體途徑，用IL-1RI-1-鼠巨噬細胞感染實驗，觀察IL-1α是否通過IL-1R I途徑參與C.trachomatis誘導IL-8；并通過免疫熒光觀察IL-1α和IL-8亞細胞定位以及真核細胞pDsRed-pro-IL-1α質粒轉染實驗，進一步明確IL-1α參與C.trachomatis誘導IL-8的機制。 5.通過免疫印

5、跡檢測C.trachomatis和C.muridarum(小鼠生物型C.trachomatis)感染上皮細胞后caspsase-1的活化；用easpsase-1-1-鼠生殖道感染C.muridarum，制備C.muridarum生殖道感染動物模型，監(jiān)測感染鼠IFU情況，觀察小鼠對C.muridarum初次感染、再次感染的易感性和C.muridarum的清除，以及初次感染、再次感染后小鼠生殖道病理改變。 研究結果： 1.通

6、過ELISA、RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)C.trachomatis感染可誘導上皮細胞產(chǎn)生IL-1α、IL-β、IL-6、IL-8等細胞因子，呈時間-劑量依賴性；并且IL-1β、IL-6、IL-8在細胞內(nèi)和細胞外表達改變的情況是一致的，IL-1α則不同，C.trachomatis感染36h后觀察到細胞內(nèi)IL-1α升高，直至感染60h才檢測到細胞外IL-1α；用免疫熒光技術觀察C.trachomatis感染的細胞內(nèi)IL-8表達增高，聚集在高爾

7、基體內(nèi)。 2.用免疫印跡法檢測到C.trachomatis感染后可以激活MAPK通路中ERK和P38通路，呈時間依賴性，與C.trachomatis感染誘導IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8等細胞因子的產(chǎn)生具有一定的相關性；通過化學抑制劑分別抑制MAPK三條通路，發(fā)現(xiàn)P38信號通路參與C.trachomatis誘導IL-1α、IL-6、IL-8，ERK信號通路僅參與C.trachomatis誘導IL-8。 3.通

8、過RT-PCR和ELISA方法發(fā)現(xiàn)HT29、HGF兩株細胞系不表達內(nèi)源性IL-1α，C.trachomatis感染也不能誘導HT29、HGF產(chǎn)生IL-8；SiHa、Hela229、Hep2細胞系表達內(nèi)源性IL-1α，C.trachomatis感染誘導其產(chǎn)生IL-8；IL-1α siRNA和IL-1α-1-鼠巨噬細胞感染實驗進一步證實C.trachomatis通過IL-1α誘導IL-8產(chǎn)生。 4.通過IL-1Ra和IL-1α中和抗

9、體阻礙IL-1α與IL-1R I結合，發(fā)現(xiàn)在C.trachomatis感染48h，阻斷IL-1RI受體途徑并不影響IL-8產(chǎn)生，C.trachomatis感染72h阻斷IL-1R I受體途徑可以部分顯著地抑制IL-8產(chǎn)生。IL-1R I-1-鼠巨噬細胞C.trachomatis感染實驗，顯示在C.trachomatis感染48h，IL01R I-1-鼠巨噬細胞IL-8產(chǎn)生與野生對照鼠無差異。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)C.trachomatis刺激

10、細胞內(nèi)IL-1α進入細胞核，同時誘導IL-8產(chǎn)生；將pDsRed-pro-IL-1α質粒轉染Hela229細胞發(fā)現(xiàn)，pDsRed-pro-IL-1α可以進入細胞核誘導IL-8產(chǎn)生。 5.免疫印跡實驗檢測到C.trachomaas和C.muridarum感染后可活化caspase-1；將C.muridarum感染caspaSe-1-1-鼠生殖道，制備C。muridarum生殖道感染動物模型，發(fā)現(xiàn)caspase-1不影響小鼠對C。murid

11、arum的易感性，無論初次還再次感染，caspase.1-1-鼠清除C.muridarum能力與對照組相比無顯著差別。制備病理切片評估小鼠生殖道炎癥程度，顯示caspase-1-1-鼠輸卵管的炎癥損傷在初次感染后較野生對照組顯著減輕(p<0.05)。 結論： 1.活化MAPK/ERK通路參與C.trachomatis誘導炎癥因子IL-8的產(chǎn)生，活化MAPK/P38通路參與C.trachomatis誘導炎癥因子IL-1α、