大鼠脫細(xì)胞腎臟骨架的構(gòu)建及細(xì)胞相容性檢測(cè).pdf

1、背景:目前,慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的發(fā)病率逐年增加,進(jìn)入CKD終末期的患者數(shù)量也在上升。透析和腎移植是目前主要的替代治療方式,而腎移植是最有效和理想的治療模式,但它的前提是必須有充分的器官來源,而我們國(guó)家器官短缺的問題非常突出。此外,異體移植的腎臟在宿主體內(nèi)會(huì)受到免疫系統(tǒng)的攻擊,腎臟移植患者需長(zhǎng)期口服免疫抑制劑以避免排異反應(yīng),但藥物的副作用也是眾所周知的。近年來組織工程的發(fā)展使再生器官作為移

2、植器官的來源成為可能。良好的組織工程材料是器官再生的關(guān)鍵,但由于腎臟結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,目前人工合成材料無法構(gòu)建如此復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。器官脫細(xì)胞的方法的出現(xiàn)使無細(xì)胞成分的器官骨架作為器官再生的組織工程材料成為可能。脫細(xì)胞的腎臟骨架保留了腎臟的復(fù)雜結(jié)構(gòu),而且其細(xì)胞外基質(zhì)成分中有誘導(dǎo)細(xì)胞定植與分化的信號(hào),這些因素都有利于腎臟再生。目前國(guó)外已有一些器官細(xì)胞洗脫方面的研究,但國(guó)內(nèi)這方面的研究還很少。
　　目的:利用細(xì)胞洗脫的方法構(gòu)建無細(xì)胞成分的腎臟骨

3、架;對(duì)骨架的微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)和鑒定;檢測(cè)脫細(xì)胞腎臟骨架對(duì)多種細(xì)胞的毒性;觀察大鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在脫細(xì)胞腎臟骨架中的存活情況。
　　方法:(1)取出帶有動(dòng)靜脈通路的腎臟,通過動(dòng)脈向腎臟內(nèi)持續(xù)依次灌注1％的十二烷基磺酸鈉(sodium dodecylsulfatesodium salt,SDS)溶液和1%的Triton-X100溶液,在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察腎臟形態(tài)和顏色的變化,并利用蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin

4、and Eosin stain,HE)觀察是否有細(xì)胞成分殘留,腎臟骨架結(jié)構(gòu)是否完整;電鏡觀察腎臟骨架的超微結(jié)構(gòu);并用免疫組化及過碘酸-希夫氏染色(Periodic Acid-Schiff stain)的方法檢測(cè)腎臟骨架細(xì)胞外基質(zhì)成分的保留情況。
　　(2)利用浸泡過脫細(xì)胞腎臟骨架的培養(yǎng)基(脫細(xì)胞腎臟骨架浸提液)處理大鼠腎臟系膜細(xì)胞系、大鼠成纖維細(xì)胞系49F細(xì)胞、人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞、小鼠條件永生化足細(xì)胞系(MPC5),用

5、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和壞死率。
　　(3)培養(yǎng)大鼠的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,收集1×107數(shù)量的細(xì)胞,通過脫細(xì)胞腎臟骨架的動(dòng)脈灌注到腎臟骨架中培養(yǎng),觀察大鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在骨架中的存活情況。
　　結(jié)果:(1)依次用1%的SDS溶液灌注12h,1%的Triton-X100溶液灌注30min后,腎臟變?yōu)榘咨胪该鳡?HE染色顯示脫細(xì)胞腎臟骨架無細(xì)胞成分殘留,重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、

6、彈性蛋白、糖蛋白都得到保留,電鏡顯示脫細(xì)胞腎臟骨架內(nèi)無明顯細(xì)胞成分殘留,基底膜連續(xù)完整,系膜基質(zhì)也得到保留。
　　(2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎臟骨架浸提液處理過的大鼠腎臟系膜細(xì)胞、49F細(xì)胞、HK-2細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組無明顯差異;流式細(xì)胞儀檢測(cè)浸提液處理后細(xì)胞的凋亡率和壞死率與對(duì)照組也無明顯差異。
　　(3)大鼠脫細(xì)胞腎臟骨架內(nèi)有iPSCs存活。
　　結(jié)論:(1)利用1%SDS溶液和1%Triton-X100溶液能成功