納米骨細(xì)胞支架的制備、生物相容性檢測及體外聯(lián)合培養(yǎng)觀察.pdf

1、背景:骨質(zhì)缺損的臨床治療長期以來一直是骨科領(lǐng)域中尚待解決的難題之一.其根本原因是尚未找到一種理想的骨組織替代物,理想的材料應(yīng)當(dāng)是:1、與人體組織相容性好,無免疫源反應(yīng);2、與人骨力學(xué)性能相似,具有一定的強(qiáng)度和支撐力;3、應(yīng)有良好的誘導(dǎo)成骨活性;4、取材方便,易于大量制作;5、能被宿主骨組織吸收替代.在骨組織工程研究中,現(xiàn)行的材料都不十分理想,傳統(tǒng)的植入材料,例如:金屬、陶瓷、高分子植入物在人體內(nèi)永遠(yuǎn)是異物,在生物相容性、生物活性、生物可

2、降解性及與宿主骨的力學(xué)匹配性等方面都有各自的缺點(diǎn),自體骨移植效果雖好,但來源有限,尤其是對于兒童和老人.因此,全世界都在尋找一種易塑形、生物相容性好、有足夠強(qiáng)度的骨缺損修復(fù)材料.骨組織工程的三個關(guān)鍵要素是信號分子(骨生長因子、骨誘導(dǎo)因子)、特定組織的細(xì)胞和細(xì)胞載體材料.其中研制理想的細(xì)胞載體材料是組織工程的關(guān)鍵.一方面,它必須滿足各種生物相容性、生物可降解性及力學(xué)性能要求;另一方面,它還必須易于制成各種理想的形狀以適于細(xì)胞與載體的復(fù)合,

3、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在三維空間的生長、組織再生.這也是目前骨組織工程的難點(diǎn).細(xì)胞載體材料分為可吸收材料與不可吸收材料兩大類,從目前的使用情況看,可吸收材料比不可吸收材料好.可吸收材料(多孔結(jié)構(gòu))包括以下幾類:(1)合成和天然礦物:活性生物陶瓷、脫有機(jī)物的骨礦、磷酸三鈣.(2)天然高分子:各類膠原;(3)合成高分子:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸.活性生物陶瓷一般具有促使人體硬組織的再生和修復(fù)的作用,其中磷酸鈣鹽生物陶瓷材料對宿主組織具有良好的生物相容性

4、,對人體無毒,無刺激,無過敏,不致癌,在人體內(nèi)不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng).因此生物陶瓷材料是目前較為理想的組織支架材料.但是人體不同組織長入需要不同的孔徑.結(jié)締組織長入,微孔徑應(yīng)為50 μ m,而骨組織長入需100μ m,低于100μ m時(shí)骨長入受限,孔徑大于250 μ m時(shí)才有完整骨單位長入.此外對生物陶瓷要求不僅有適宜的孔徑大小,而且為了要增加骨融合速度,很重要的一點(diǎn)是孔隙率要高,以天然珊瑚制成的人工骨為例,孔隙直徑200 μ m,孔隙率僅

5、僅53﹪.當(dāng)這種人工骨與宿主骨結(jié)合后,形成類似"磚石混凝土結(jié)構(gòu)",較大體積的人工骨長期得不到降解,明顯形成體內(nèi)異物,嚴(yán)重影響骨融合速度.目的:研制一種具有骨誘導(dǎo)能力和一定強(qiáng)度,適于成骨細(xì)胞爬行替代的可降解高孔隙率支架作為細(xì)胞載體材料.我們通過與天津大學(xué)材料學(xué)院、中科院固體材料研究所合作,研制出一種孔隙率高,抗壓強(qiáng)度大的磷酸鈣成骨細(xì)胞爬行支架生物陶瓷.將納米氧化鋯顆粒和羥基磷灰石復(fù)合制作的.方法:分為以下方面進(jìn)行研究一、支架的制備實(shí)施方法

6、:1:羥基磷灰石制備本發(fā)明以醫(yī)用級碳酸鈣(CaCO<,3>)和二水磷酸氫鈣(CaHPO<,4>·2H<,2>O)為原料,按一定Ca/P摩爾比,將所稱料倒入球磨罐中,加入去離子水和氧化鋯磨球.將混合料高速球磨24小時(shí),再將混合料移入水熱反應(yīng)釜中,反應(yīng)溫度為120℃,壓力為3MPa,反應(yīng)40分鐘之后將混合料取出,在烘箱中于85℃恒溫干燥,干燥后在800℃煅燒,獲得長徑比約為10的針狀羥基磷灰石粉末.2:納米氧化鋯顆粒制備本發(fā)明采用按氧化鋯和

7、氧化釔的摩爾比為97:3溶入40℃去離子水中,以此作為基液;將濃度為3N的氨水同時(shí)滴入基液中,并不斷攪拌,在整個反應(yīng)過程溶液的溫度保持在40~45℃之間,pH值在9~10之間,待沉淀完全生成后再繼續(xù)攪拌1/2小時(shí);將沉淀過濾、水洗3遍,再醇洗2遍,完全去除Cl-離子;把離心過濾后的沉淀物在烘箱中干燥,溫度不超過80℃,干燥后粉末過80目篩,于800℃煅燒1小時(shí),冷卻后過200目篩,制得的ZrO<,2>(Y<,2>O<,3>)復(fù)合粉末粒徑

8、在20~50nm之間.氧化鋯粉末的粒徑為20~50nm.3:納米氧化鋯增強(qiáng)β-磷酸鈣(β-磷酸鈣/氧化鋯)高孔隙率成骨細(xì)胞爬行支架的制備稱取一定比例納米氧化鋯顆粒和羥基磷灰石粉末,并加入含SiO<,2>和Na<,2>O的復(fù)合添加劑成復(fù)合粉末.將復(fù)合粉末加入去離子水中,在微粒球磨機(jī)上混磨4小時(shí),磨球?yàn)檠趸喦?混磨后的料漿倒入盛料槽中,選用孔隙率92﹪,孔徑300um的聚氨酯海綿并用NaOH堿液處理,然后浸入料漿中,而后將浸有料漿的海綿取

9、出,通過碾輪將海綿中的多余料漿碾出;被料漿包裹的海綿成型體在室溫干燥12小時(shí)之后,再在烘箱中干燥;干燥試樣在燒結(jié)爐中燒結(jié).結(jié)果:經(jīng)過天津大學(xué)材料學(xué)研測試:氣孔率為75﹪~93﹪,孔徑大小在200~450μm之間,孔分布均勻、貫通,抗壓強(qiáng)度2.0MPa.二、支架的生物學(xué)評價(jià)實(shí)施方法:1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)采用納米支架材料的浸提液,按下面兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn):1)細(xì)胞形態(tài)觀察法:用待測材料及陰、陽性參照材料的標(biāo)準(zhǔn)濃度浸提液在Φ35mm培養(yǎng)皿內(nèi)

10、,按細(xì)胞密度為6×10<'4>/ml培養(yǎng)Hos8603成骨細(xì)胞,通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況.2)MTT法:細(xì)胞相對增值率(RGR)=(實(shí)驗(yàn)組A均值/陰性對照組A均值)×100﹪,再根據(jù)計(jì)算值進(jìn)行細(xì)胞毒性分級.2.全身急性毒性試驗(yàn):該實(shí)驗(yàn)采用支架材料的浸提液小鼠尾經(jīng)脈注射,陰性對照為同批號生理鹽水,陽性對照為6.4﹪苯酚溶液,注射后24h、48h、72h稱量體重變化,觀察一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)及死亡情況.3.溶血試驗(yàn):該實(shí)驗(yàn)采用支架

11、材料的浸提液作體外實(shí)驗(yàn),測定兔紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度,對其體外溶血性進(jìn)行評價(jià).結(jié)果:1.支架材料細(xì)胞毒性為0~1級.2.支架材料組小鼠的全身一般狀況良好,未見明顯毒性表現(xiàn),體重均出現(xiàn)增長現(xiàn)象,72h觀察期內(nèi)活動如常,飲食飲水均正常,無動物死亡現(xiàn)象.3.支架材料的溶血率為2.064﹪,體外實(shí)驗(yàn)不引起溶血反應(yīng).三、Hos8603細(xì)胞與支架聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)實(shí)施方法:1.用成骨細(xì)胞株Hos8603與納米支架浸提培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液培養(yǎng),分別倒置

12、顯微鏡觀察細(xì)胞生長、增殖情況,并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率,了解支架材料對細(xì)胞生長的影響,并繪制出細(xì)胞生長曲線.2.用成骨細(xì)胞株Hos8603與支架復(fù)合進(jìn)行培養(yǎng),電鏡觀察細(xì)胞與支架材料黏附情況,判斷支架材料對細(xì)胞黏附性能.結(jié)果:實(shí)驗(yàn)中觀察到納米骨支架浸提液培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細(xì)胞株Hos8603其生長曲線與陰性對照體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞無顯著差異,兩條生長曲線基本重疊.培養(yǎng)第一天增加不明顯,在第二天到第四天曲線有明顯上升趨勢,數(shù)值變化較大,第五天增長趨勢趨緩,

13、第六天曲線開始下降.兩組細(xì)胞均表現(xiàn)出了相同的趨勢和規(guī)律.四、原代兔成骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)施方法:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化粗穿刺針頭插入兔股骨髓腔,快速負(fù)壓抽吸骨髓液,移入已裝有2ml 100u/ml肝素鈉抗凝液離心管中,抗凝與37℃預(yù)熱DMEM培養(yǎng)液混勻.骨髓抗凝液中加入紅細(xì)胞裂解液8ml,靜置10min,1500g離心8分鐘,將沉淀的大單核細(xì)胞混懸,移入50ml培養(yǎng)瓶37℃、5﹪CO<,2>及飽和濕度條件下培養(yǎng),每天觀察,第4天換液.骨髓

14、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)7天,換用含誘導(dǎo)作用的培養(yǎng)液(10mmol/L β-甘油磷酸鈉,10nmol/L地塞米松,50mg/ml抗壞血酸)繼續(xù)培養(yǎng),隔天換液,使間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,長滿瓶底80﹪-90﹪,用0.5﹪胰蛋白酶消化,以1傳2常規(guī)傳代培養(yǎng).鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài).2.成骨細(xì)胞的鑒定2.1堿性磷酸酶染色細(xì)胞爬片經(jīng)固定后行改良鈣鉆法進(jìn)行堿性磷酸酶染色,可見細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上有粗大的深褐色顆粒存在,有些甚至成片而遮蔽細(xì)胞核.2.2堿性磷

15、酸酶活性定量測定(測定盒購自南京建成生物工程研究所)堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉,產(chǎn)生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據(jù)紅色深淺可以測定酶活力的高低.2.3成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)定量測定蛋白質(zhì)分子具有-NH<,3>基團(tuán),當(dāng)棕紅色的CBBG250染料上的陰離子與蛋白-NH3結(jié)合,使溶液變成為藍(lán)色,通過測吸光度可以計(jì)算出蛋白含量結(jié)果:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮?長多邊形,有明顯突起

16、,少數(shù)細(xì)胞呈星形.在傳代培養(yǎng)后期,出現(xiàn)細(xì)胞呈鱗片樣聚集生長趨勢,胞漿淺,但可見有顆粒樣物質(zhì)出現(xiàn),并由少變多,細(xì)胞核變大,有1-2個核仁,可見處于核分裂相細(xì)胞.表現(xiàn)出成骨細(xì)胞形態(tài)改變.經(jīng)堿性磷酸酶染色鑒定為表形活躍的成骨細(xì)胞,染色結(jié)果判定為3+.檢測堿性磷酸酶活性為10.72金氏單位/萬細(xì)胞或45.8金氏單位/毫克.五、原代兔成骨細(xì)胞與納米骨支架聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)施方法:用3代兔成骨細(xì)胞與支架復(fù)合進(jìn)行培養(yǎng).并利用改進(jìn)的MTT法進(jìn)行三維支架中兔成骨