灌注法制備大鼠及家兔全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的研究.pdf

1、組織工程學(xué)是一門近年來新興的綜合性學(xué)科，是一門運(yùn)用細(xì)胞、工程材料學(xué)方法和創(chuàng)造適當(dāng)生化、理化因素，以改善或替代組織的生物學(xué)功能的學(xué)科，是人類治療組織、器官的功能衰竭和缺失的研究方向。其基本原理和方法是令少量組織細(xì)胞通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)量后，接種到具有一定空間結(jié)構(gòu)的支架上，構(gòu)成有生命活力的細(xì)胞支架復(fù)合物，并移植到體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)或替代組織損傷的目的。近年來，組織工程學(xué)有了迅猛的發(fā)展，對多種組織均有相應(yīng)的組織工程器官面世的報道，如骨、軟

2、骨、血管、膀胱等，尤其在泌尿系統(tǒng)組織工程學(xué)上，國外學(xué)者更已將組織工程膀胱投入臨床試驗(yàn)，成為首個植入人體內(nèi)的真正意義上的組織工程人造器官。它既為眾多研究者們建立了典范，同時也開啟了更為廣闊的未知領(lǐng)域：是否所有的人體組織均能通過組織工程學(xué)的方法創(chuàng)造出入造器官？然而由于人體各器官結(jié)構(gòu)、功能、代謝環(huán)境各異，如何在現(xiàn)有科學(xué)水平下成功制備并植入具有正常代謝及功能的器官，仍有許多難題留待研究者們克服。 研究背景: 器官或組織的功能衰竭

3、和缺失，是嚴(yán)重危害人類健康的最為常見的疾病。人類嘗試?yán)酶鞣N替代材料進(jìn)行器官或組織的替代修復(fù)，取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。在泌尿系統(tǒng)，膀胱、尿道、輸尿管等器官除了已有常規(guī)的自體組織移植手術(shù)方法，也有其它材料的替代手段，如對于膀胱可用腸代膀胱，也有組織工程膀胱的報道。然而對于慢性腎臟功能衰竭的患者，或腎腫瘤、腎外傷的獨(dú)腎患者，目前的治療手段僅限于透析或異體腎移植。前者費(fèi)用高昂且并非根治手段，對患者及其家庭造成沉重負(fù)擔(dān)；后者除費(fèi)用高昂外，還受腎源短缺

4、、術(shù)后長期使用免疫抑制劑等因素限制而不能對每個患者實(shí)施。截至本研究完成前，國內(nèi)外尚未有組織工程腎體外構(gòu)建成功的案例，并且學(xué)者們的研究重點(diǎn)均在于如何體外培育腎細(xì)胞，而合適的細(xì)胞支架則一直鮮有提及。本研究實(shí)驗(yàn)從尋找合適的細(xì)胞支架的角度出發(fā)，希望通過制備無細(xì)胞的、生物相容性及降解性良好的細(xì)胞支架，為構(gòu)建組織工程腎打下基礎(chǔ)。 研究目的: 1．探討灌注法制備大鼠的全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)（ACM）支架的條件和方法。 通過對多種細(xì)胞

5、支架的比較發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞基質(zhì)（AcellularMatrix）是一種良好的細(xì)胞支架。它具有原組織的宏觀及微觀結(jié)構(gòu)，并且富含膠原、彈力纖維，并含微纖維蛋白、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等。經(jīng)脫細(xì)胞后留下的細(xì)胞外基質(zhì)成分具有良好的生物相容性，并且各種組成的成分分別攜帶或接收不同的信號，誘導(dǎo)不同的細(xì)胞，因而對于細(xì)胞類型中基因表達(dá)方式，細(xì)胞的粘附、移行、轉(zhuǎn)移等都有極重要的影響。目前制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法基本局限于以酶或去污

6、劑浸泡洗脫，而對實(shí)質(zhì)性臟器基本無法達(dá)到脫細(xì)胞的目的。本研究以去污劑為洗脫細(xì)胞的溶劑，引入灌注法，通過血管、腎小球、腎小管這一自然平臺達(dá)到將腎臟內(nèi)部細(xì)胞洗脫的目的，并在研究過程中探討、建立一套系統(tǒng)的制備方法。 2．觀察并證明所制備的全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)具有規(guī)則的三維空間結(jié)構(gòu)，良好的孔隙率，且已將細(xì)胞完全洗脫。 由于已將在移植中產(chǎn)生抗原性的最重要成分——細(xì)胞洗脫，余下的脫細(xì)胞基質(zhì)不存在MHC抗原。后者所誘發(fā)的免疫反應(yīng)為類Th-2

7、反應(yīng)，與異種移植誘發(fā)的典型Th-1反應(yīng)不同。而這種反應(yīng)對植入的脫細(xì)胞基質(zhì)并無排斥作用，表明了脫細(xì)胞基質(zhì)具有種屬差異性小、生物相容性佳等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)本研究建立的方法所制備的脫細(xì)胞基質(zhì)，在肉眼觀察下呈均一白色半透明，通過HE染色光鏡觀察、掃描電鏡觀察及細(xì)胞核特異性結(jié)合染色熒光顯微鏡觀察等方法檢測，從而說明其具有良好的微觀孔隙結(jié)構(gòu)以利于細(xì)胞生長，且已將細(xì)胞完全洗脫。 3．將制備全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的方法推廣至家兔并作微觀觀察。 在成功

8、制備大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上將方法推廣至家兔，并作相應(yīng)的微觀觀察，說明建立的制備方法簡便、可靠，具有系統(tǒng)性，有望推廣至豬甚至人類等更大的哺乳類動物。 研究方法: 1．大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備。 取12周齡的Whistar大鼠共20只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉下完整切除兩側(cè)腎臟，分別保留輸尿管、腎靜脈及腎動脈。每對腎臟隨機(jī)取1只作對照組，另1只作實(shí)驗(yàn)組。所有腎臟均沿腎動脈插入留置針建立灌注通道。實(shí)驗(yàn)組以肝素

9、化PBS溶液輕推測試通道密閉性完整后，依次灌注肝素化PBS溶液，1%十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液，去離子水，1%TritonX-100溶液以及含青鏈霉素的PBS溶液。調(diào)整灌注壓強(qiáng)及灌注時間，經(jīng)修正獲得最佳方案。 2．大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的微觀觀察。 按最佳方案脫細(xì)胞處理后，取其中12對標(biāo)本隨機(jī)分配3組，每組4對，分別采用HE染色法光鏡（Ⅰ組）觀察、掃描電鏡（Ⅱ組）觀察支架微觀結(jié)構(gòu)，DAPI染色法熒光顯微鏡（Ⅲ組）觀察殘留

10、細(xì)胞核成分。Ⅰ組經(jīng)10%甲醛灌注固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察標(biāo)本。Ⅱ組經(jīng)2．5%戊二醛灌注固定，梯度法丙酮脫水、乙酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)法干燥、真空噴鍍后掃描電鏡下觀察標(biāo)本。Ⅲ組經(jīng)10%甲醛灌注固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察標(biāo)本。所有觀察結(jié)果以圖像記錄。 3．家兔全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及微觀觀察。 參考大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法作適當(dāng)調(diào)整，其中麻醉改為耳

11、緣靜脈注射25%烏拉坦，其余基本一致。制備成功后按大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)微觀觀察方法作觀察。同樣以圖像記錄觀察結(jié)果。 研究結(jié)果: 1．大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備最佳方案及灌注過程。 共對20只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。前8例中，非麻醉（處死）處理1例；取腎時腎動脈撕裂出血1例；插管時針芯刺破腎動脈引起灌注液漏1例，結(jié)扎致留置針管折損1例；測試灌注通道密閉性時壓力過大致腎破裂1例；灌注后部分腎段完全無灌注1例，部分無灌注1例。后

12、12例按最終方案成功灌注制備全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)。 按最終方案制備的過程中，開始灌注液流速慢，約10～40滴/min，隨后逐漸加快。更換1%SDS后腎顏色從外至內(nèi)分段逐漸變白色半透明，120～150min顏色變化逐漸明顯，基本可在肉眼下看清腎內(nèi)分支狀管脈結(jié)構(gòu)，直至約180～240min腎完全呈均一白色半透明狀，灌注液滴速保持在100～120滴/min，此時測量灌注液總使用量約400～600ml。 2．大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的微

13、觀檢測結(jié)果。 HE染色光鏡觀察結(jié)果：對照組可見組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核清晰；實(shí)驗(yàn)組可見僅留下脫細(xì)胞基質(zhì)形成的腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)，腎小球及腎小管內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞殘留。 掃描電鏡觀察結(jié)果：對照組可見腎小球及近曲小管等結(jié)構(gòu)完整；實(shí)驗(yàn)組可見腎小體、腎小管周圍的基膜及膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其余空間均為形狀規(guī)則的孔隙，內(nèi)無細(xì)胞。 DAPI染色觀察結(jié)果：對照組可見細(xì)胞密布，DAPI與細(xì)胞核結(jié)合后發(fā)出比自身強(qiáng)許多倍的熒光；

14、實(shí)驗(yàn)組僅見細(xì)胞外基質(zhì)呈網(wǎng)狀，發(fā)出微弱的熒光，未見DAPI與細(xì)胞核結(jié)合后發(fā)出的強(qiáng)熒光。 3．家兔全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)制備及微觀觀察結(jié)果。 9例均成功制備全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)。灌注開始時灌注液流速同樣緩慢，約10～40滴/min，隨后逐漸加快。更換1%SDS后腎顏色從外至內(nèi)呈分段分葉狀逐漸變白色半透明，120～150min顏色變化逐漸明顯，基本可在肉眼下看清腎內(nèi)分支狀管脈結(jié)構(gòu)，直至約720～960min腎完全呈均一白色半透明狀，灌注