去細胞化肝臟支架組織相容性及體外細胞共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、研究背景:我國是肝病大國,對于終末期肝衰竭患者十分常見。然而,到目前為止,針對終末期肝病的根治性方法只有肝臟移植。受到器官短缺及長期服用抗排斥藥物等不利因素,這種治療方法遠遠不能滿足臨床上的需求,許多需要肝臟移植的病人在等待肝源的過程中死去。生物人工肝系統(tǒng)作為一種有效手段已經用于急性肝衰竭(ALF)治療,或作為等待肝源及肝移植后恢復階段的肝臟替代治療。但是受到技術限制、生物安全性及成本較大等因素的影響,現有的人工肝系統(tǒng)還有待進一步的改進

2、?？傊?現有的肝臟替代治療手段都未能完全滿足臨床的需要,尋求一種安全、經濟、有效的肝臟功能替代療法已經十分迫切,肝臟組織工程是構建可移植肝臟的一條創(chuàng)新型途徑,其核心內容是利用生物學和工程學的原理,通過將大量肝細胞(或肝樣細胞)、內皮細胞等細胞材料與生物支架材料相復合,構建出一個可供移植的組織工程肝臟,用以對病損肝臟進行形態(tài)、結構及功能上的永久性替代。因此,組織工程肝臟的研究對緩解現有肝臟治療措施的不足具有重大的研究意義。
　　

3、由于肝臟的組織結構及生理功能復雜,組織工程化肝臟對于種子細胞和支架材料的要求就更為苛刻。良好的支架材料應有足夠的表面積用于細胞粘附,也應有足夠的空間使細胞集落擴展,增殖,足夠的孔隙以利于物質與氣體的交換,具有可降解性,良好的生物相容性。然而,相對于復雜的肝臟結構,以往所使用的人工合成支架材料都顯得過于簡單,無法滿足肝細胞高密度生長所需營養(yǎng)供應的要求,更無法模擬肝臟組織復雜的細胞生長環(huán)境。因此,尋找最大限度模擬體內肝細胞生長微環(huán)境的三維支

4、架材料用于肝細胞培養(yǎng),保證細胞的數量、形態(tài)及功能的維持,是解決組織工程化肝臟構建的首要問題。
　　 去細胞化支架的出現,從根本上打破了傳統(tǒng)支架材料結構簡單的局限。去細胞化支架是指通過化學或物理的方法將細胞破壞并從組織中完全移除,完好地保留了細胞外基質(ECM)及組織器官的三維支架結構,早已成為組織工程研究中的熱點。去細胞化肝臟生物支架與以往的支架材料相比有著明顯的優(yōu)勢。首先,它保留的三維網狀結構為肝細胞生長提供了所需的微環(huán)境。去

5、細胞化肝臟支架保留了肝臟的大部分細胞外基質包括膠原,彈性纖維,蛋白聚糖等組分。這些成分不僅對于肝細胞的粘附、生長等生物學行為過程中起到重要作用,而且能夠與周圍的細胞發(fā)生交互作用,為細胞的分化、遷移及細胞之間相互作用提供信號。第二,支架中保留的血管網絡解決了肝細胞生長所必需的營養(yǎng)輸入與廢物排出的難題,從而使肝細胞的組織化培養(yǎng)成為可能。另外,由于細胞外基質成分在不同的物種之間具有高度保守性,所以去細胞化技術得到的細胞外基質支架具有良好的生物

6、相容性及低免疫原性。最后,細胞外基質中可能遺留的生物活性成分具有促進細胞生長、增殖及分化的生物特性。至今,去細胞化支架已成功地應用于心血管、輸尿管、膀胱等組織器官的研究中。由于去細胞化技術在肝臟組織工程中的應用起步較晚,再加上肝臟結構極其復雜,利用去細胞化肝臟支架進行可移植組織工程化肝臟的重建還很長時間的探索。另一方面,去細胞化肝臟支架所構建的組織工程化肝臟必須通過異體移植的形式發(fā)揮作用。去細胞化肝臟支架移植到受體體內,組織相容性是考察

7、支架能夠移植的檢測標準之一。如細胞成分去除不徹底則可引發(fā)嚴重的免疫排斥反應,炎癥反應不僅可以導致組織細胞降解,同時也是組織鈣化的又一個重要原因。然而,既使去除了組織細胞表面的大部分高免疫源性物質如組織相容性(MHC)Ⅰ和Ⅱ類蛋白,由于在去細胞化過程中可能殘留了少量的細胞碎片和脂質成分,以及去細胞過程中引發(fā)的支架結構的改變,因此仍然存在引發(fā)免疫排斥反應或導致支架結構鈣化的可能。至今,還未見關于去細胞化肝臟支架異體組織相容性的相關報道。因此

8、,積極探索利用去細胞肝臟支架構建具有肝臟功能的組織工程化肝臟,同時進行去細胞化肝臟支架組織相容性研究都具有重要的意義。
　　 本課題組在既往工作中己成功使用化學去垢劑方法制備去細胞化全肝臟支架。在此基礎上,本實驗進一步優(yōu)化去細胞化大鼠肝臟的制作流程,使去細胞化效果更加穩(wěn)定。緊接著,我們利用去細胞化肝臟支架保留的管道結構連接到體外的循環(huán)裝置上,并與肝臟腫瘤細胞系C3A細胞進行體外循環(huán)共培養(yǎng)。實驗證實細胞在流動的狀態(tài)下與支架結構緊密

9、地粘附,并能夠在較長時間里保持一定的功能與活性。實驗結果說明:去細胞化肝臟支架保留的肝內管道結構為在其上進行干細胞的高密度培養(yǎng)創(chuàng)造了條件,在去細胞化肝臟支架上種植肝細胞并進行細胞循環(huán)灌注培養(yǎng)甚至肝臟再生是現實可行的。另外,通過去細胞化肝臟支架組織異體皮下植入實驗我們也可以看出:利用Trixton-100及SDS化學去垢劑制備的去細胞化肝臟支架脫細胞化效果完全,去細胞化后的肝臟支架結構具有良好的組織相容性及低免疫源性,這說明使用去細胞化肝

10、臟支架作為支架材料適合異體移植,為進一步構建可供移植的組織工程化肝臟的研究提供了理論基礎。
　　 第一章:去細胞化肝臟支架體外循環(huán)灌注培養(yǎng)實驗
　　 目的:利用去細胞全肝臟生物支架進行體外肝細胞循環(huán)灌注培養(yǎng),并對所得到生物支架進行功能測定及組織學觀察,為進一步的體外肝臟組織重建奠定實驗基礎。
　　 方法:以SD大鼠作為研究對象,利用化學去垢劑方法制備全肝臟生物支架。首先取SD大鼠肝臟,將所得肝臟經門靜脈插管后依次

11、灌注曲拉通X100(TritonX100),十二烷基磺酸鈉(SDS),用時約8小時,并用0.01mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗支架上殘留SDS210h,將支架結構中的肝靜脈、膽管及肝動脈以1＃絲線結扎。去細胞化肝臟支架經過氧乙酸(0.1％)消毒后使用PBS溶液反復沖洗干凈,使用1ml注射器將5mlLO2細胞(約為2×107個/ml)經去細胞化肝臟支架門靜脈注入支架中。再利用去細胞化肝臟支架保留的門靜脈系統(tǒng)連接到體外自制的循環(huán)培養(yǎng)裝置(

12、附帶恒溫箱、氧合器、蠕動泵、混合氣體罐及培養(yǎng)基等)進行體外循環(huán)培養(yǎng)10天,每2天換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)期間定期檢查細胞的功能狀態(tài)及循環(huán)系統(tǒng)的污染狀況。最后取出標本經多聚甲醛脫水固定,石蠟包埋后切片行HE染色觀察組織細胞的生長及分布狀況。
　　 結果:利用去細胞化肝臟支架構建的體外循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)共進行了11次體外循環(huán)培養(yǎng)。其中共有2次培養(yǎng)過程中放生污染,主要原因可能為在構建體外循環(huán)裝置和培養(yǎng)換液過程中的操作不當導致。其余9次培養(yǎng)過程中未

13、出現污染,其中最初5次培養(yǎng)過程中發(fā)現培養(yǎng)期間細胞生長狀況較差,培養(yǎng)3天可見培養(yǎng)液中大量細胞碎片,生化功能檢測顯示肝細胞生長狀態(tài)差,經病理切片檢測可見大部分細胞脫落,支架上殘留大量細胞殘片及少量肝細胞。分析原因可能為氧氣供給不合理,循環(huán)灌注速度過快導致細胞受剪切力影響受損等多種原因。后來通過逐漸地摸索和改進循環(huán)培養(yǎng)方法,培養(yǎng)的結果有了很大的改善。
　　 結論:利用化學去垢劑法制備去細胞化全肝臟支架重復性好。體外循環(huán)灌注培養(yǎng)是利用去

14、細胞化肝臟支架構建組織工程化肝臟的可行性方法,但還需要進一步的試驗摸探索。
　　 第二章:去細胞化肝臟支架異體植入局部反應試驗
　　 目的:評價化學去垢劑法制備去細胞化肝臟支架的組織相容性,探究去細胞化肝臟支架植入異體組織后的局部反應狀況,為進一步利用去細胞化肝臟支架重建組織工程化肝臟并實現異體內移植奠定實驗基礎。
　　 方法:以SD大鼠去細胞化肝臟支架作為研究對象,首先利用化學去垢劑法制備去細胞化肝臟支架并分組

15、:實驗組參照實驗一中的去細胞化方法制備去細胞化肝臟支架,陽性對照組在制備過程中省略SDS灌洗過程。制成后使用使用過氧乙酸(0.1％)消毒(同方法一),徹底消毒后再使用PBS液反復沖洗10便,最后將支架浸泡在PBS溶液中并放置-20℃冰箱保存。實驗前取出冰凍組織并將其分別制成直徑1cm、厚1mm左右的薄片。選取5、14、21、28、35共5個植入期,每一植入期用3只巴比西小白鼠(雌雄不限),陽性對照組使用3只小白鼠。所有動物采用乙醚麻醉,

16、將支架埋置于小鼠背部皮下與肌肉之間。術后通過大體觀察、組織學觀察評價支架組織炎癥情況,有無血管形成,有無纖維囊等。根據炎性反應程度和包膜形成評級。
　　 結果:實驗組去細胞化肝臟支架脫細胞完全,呈白色半透明狀,顯微鏡下未見明顯細胞成分殘余；陽性對照組支架組織呈土黃色,鏡下可見細胞碎片殘余。皮下埋植實驗生物學反應評價結果:可見陽性對照組術后5天可見紅腫、化膿性表現。實驗組動物實驗期間無一例死亡,切口愈合良好,無紅腫、潰爛等感染癥狀