瘦素與雌激素在生長板內(nèi)的相互作用機制研究.pdf

1、第一部分ATDC5細胞不同分化時期雌激素受體α、β及瘦素受體的動態(tài)表達變化
　　目的：瘦素受體和雌激素受體都可以在生長板內(nèi)表達,但是兩者的動態(tài)表達規(guī)律及共表達還未見文獻報道。本研究擬利用ATDC5細胞株體外模擬生長板軟骨性分化期和肥大性分化期等時間段軟骨細胞狀態(tài),觀察軟骨性分化標志物Ⅱ型膠原和肥大性分化標志物X型膠原的動態(tài)變化,并觀察瘦素受體和雌激素受體在不同分化時期的動態(tài)表達特點,并探討這些變化之間的可能規(guī)律。
　　方法：

2、ATDC5細胞在ITS誘導下分化模擬軟骨內(nèi)骨化過程,阿爾新藍染色觀察染色強度;采用Realtime-PCR方法檢測4、7、14、21天不同分化時間點Ⅱ型和X型膠原、雌激素受體α、β及瘦素受體mRNA的動態(tài)表達特點;免疫熒光方法檢測瘦素受體分別和雌激素α、β受體是否存在共表達現(xiàn)象。
　　結果：ATDC5細胞在ITS誘導下呈現(xiàn)不同時期特征的分化特點,阿爾新藍染色提示染色強度隨時間變化不斷增加,Realtime PCR結果提示,Ⅱ型膠原

3、在14天時表達最高,隨后顯著降低,x型膠原表達逐漸升高,至21天時表達最高;Erα和Erβ mRNA表達水平隨著細胞增殖分化過程逐漸升高,Erα在14天時達到高峰值,然后逐漸下調(diào);Erβ則一直緩慢升高,至21天時表達最高。而Obg mRNA的表達逐漸增加,21天時表達水平出現(xiàn)高峰值。Erα/Erβ的比值在4-14天之間趨于穩(wěn)定變化,隨后迅速減小。免疫熒光顯示ATDC5細胞內(nèi)ObR分別和Erα、Erβ都存在共表達現(xiàn)象。
　　結論：A

4、TDC5細胞分化過程中,在2周左右是軟骨細胞增殖期,在3周左右軟骨性肥大期特點,雌激素受體α、β和瘦素受體在不同分化時期呈現(xiàn)動態(tài)表達特點,這可能雌激素、瘦素在不同分化時期介導不同作用的結果。
　　第二部分瘦素對ATDC5細胞內(nèi)雌激素α、β受體的調(diào)控及機制研究
　　目的：雌激素α、β受體可以在生長板各層內(nèi)表達,而且具有非配基調(diào)控的作用。瘦素可以調(diào)控生長板軟骨細胞的增殖分化。瘦素對雌激素α、β受體的調(diào)控作用未見文獻報道。本研究擬

5、利用ATDC5細胞株體外誘導至生長板軟骨性增殖期,觀察瘦素對雌激素受體α、β的調(diào)控作用,并探討MAPK信號通路在瘦素調(diào)控作用過程中的可能機制。
　　方法：ATDC5細胞在ITS誘導分化下至14天,采用Realtime-PCR和westernblot方法檢測瘦素對雌激素受體α、β mRNA和蛋白的調(diào)控作用;用westernblot檢測瘦素對MAPK磷酸化作用,然后用U0126抑制MAPK磷酸化觀察瘦素對雌激素受體mRNA和蛋白的作用

6、。
　　結果：ATDC5細胞在ITS誘導至14天,瘦素50ng/ml作用48h后可以明顯上調(diào)雌激素受體α、β mRNA和蛋白的表達水平;而且瘦素對雌激素受體的作用呈劑量依賴效應;瘦素能增加ERK信號通路的磷酸化而且呈時間效應;采用U0126抑制ERK1/2信號通路能夠減弱瘦素對雌激素受體α、β mRNA和蛋白的上調(diào)作用。
　　結論：瘦素能上調(diào)生長板軟骨細胞內(nèi)雌激素受體α、β的表達水平,而且呈劑量依賴效應,瘦素可以增加ERK1

7、/2的磷酸化,瘦素對雌激素受體的調(diào)控機制是通過ERK1/2信號傳導通路完成的。
　　第三部分雌激素對ATDC5細胞內(nèi)瘦素受體的調(diào)控及機制研究
　　目的：雌激素在長骨的生長過程中發(fā)揮基因組效應和非基因組效應,其機制是通過雌激素受體和其他信號通路完成的。瘦素受體在生長板各層內(nèi)表達,雌激素對瘦素受體的調(diào)控作用未見文獻報道。本研究擬利用ATDC5細胞株體外誘導至生長板軟骨性分化期,觀察雌激素對瘦素受體的調(diào)控作用,并探討MAPK信號通

8、路在瘦素調(diào)控作用過程中的可能機制。
　　方法：ATDC5細胞在ITS誘導分化下至14天,采用Realtime-PCR和western blot方法檢測雌激素對瘦素受體mRNA和蛋白的調(diào)控作用,并觀察劑量依賴效應;并觀察雌激素α受體激動劑PPT和β受體激動劑DPN對瘦素受體mRNA和蛋白作用;用western blot檢測雌激素對MAPK磷酸化作用,然后用U0126和雌激素受體抑制劑ICI182.780抑制MAPK磷酸化和雌激素受體

9、觀察瘦素對雌激素受體mRNA和蛋白的作用;采用RNA干擾技術抑制α受體或者瘦素受體的表達觀察對應受體的變化。
　　結果：ATDC5細胞在ITS誘導至14天,雌激素10-7M作用48h后可以明顯上調(diào)瘦素受體mRNA和蛋白的表達水平;而且雌激素對瘦素受體的作用呈劑量依賴效應,其有效劑量維持在較狹窄的范圍;相對于DPN,PPT對瘦素受體的調(diào)控作用更明顯;雌激素能增加ERK1/2信號通路的磷酸化而且呈時間效應;采用U0126抑制ERK1/

10、2信號通路以及ICI192.780抑制雌激素受體表達均能夠減弱雌激素對瘦素受體mRNA和蛋白的上調(diào)作用;雌激素α受體siRNA能抑制瘦素受體的蛋白表達,瘦素受體siRNA能抑制Era受體的表達。
　　結論：雌激素能上調(diào)生長板軟骨細胞內(nèi)瘦素受體的表達水平,而且呈劑量依賴效應,雌激素α受體發(fā)揮主導作用,雌激素能增加ERK1/2的磷酸化,其對瘦素受體的調(diào)控機制是依賴雌激素受體和ERK1/2信號傳導通路完成的。雌激素旺受體與瘦素受體之間存