心臟肥厚和心臟成纖維細(xì)胞中離子通道基因表達(dá)水平的研究.pdf

1、心臟肥厚是心臟為了應(yīng)對(duì)增強(qiáng)的工作負(fù)荷而產(chǎn)生的自適應(yīng)性過程。心臟在適應(yīng)機(jī)械超負(fù)荷的過程中會(huì)產(chǎn)生心肌細(xì)胞的肥大、成纖維細(xì)胞的增殖與分化以及多種離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和活性的改變。早期的心臟肥厚是代償性的,在增強(qiáng)了心臟負(fù)荷的同時(shí)也維持了正常的收縮功能。因?yàn)樾呐K的形態(tài)發(fā)生了變化,所以此過程也被稱為重塑;以此類推,細(xì)胞和離子通道水平的改變經(jīng)常被稱為細(xì)胞和離子通道的重塑。如果過負(fù)荷長(zhǎng)期持續(xù)存在,進(jìn)一步的心臟重塑最終可導(dǎo)致心臟衰竭。無論是代償性的

2、心臟肥厚還是心臟衰竭均能增加心律失常和猝死的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 心臟成纖維細(xì)胞是心臟中普遍存在的細(xì)胞類型,其不但在正常的心肌功能中發(fā)揮重要作用,而且在高血壓、心臟肥厚、心肌梗死和心臟衰竭中發(fā)生的有害的心肌重塑中也起著關(guān)鍵性的作用。而成纖維細(xì)胞的許多功能效應(yīng)(包括遷移、增殖與分泌性質(zhì)的增強(qiáng))都是通過分化成為肌纖維母細(xì)胞表型介導(dǎo)的。肌纖維母細(xì)胞能夠?qū)ρ仔约?xì)胞因子(TNFα、IL-1、IL-6、TGF-β等)、血管活性肽(血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮

3、素-1、利鈉肽等)和激素類(去甲腎上腺素等)產(chǎn)生響應(yīng),而以上因子的水平在心臟重塑的過程中均增加。因此,成纖維細(xì)胞為心臟肥厚提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
　　 鉀通道是分布最為廣泛的離子通道類型,存在于幾乎全部的細(xì)胞類型中,參與了很多的細(xì)胞功能,并且與眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展有重要的關(guān)系。鉀離子通道是遞質(zhì)、激素和藥物調(diào)節(jié)心臟功能的作用靶點(diǎn)。由于正常發(fā)育、損傷或疾病所導(dǎo)致的鉀離子通道的密度或性質(zhì)的改變會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生理學(xué)后果。有研究表明,與

4、心臟肥厚有關(guān)的鉀通道活動(dòng)的改變是導(dǎo)致電生理重塑和心律失常的主要因素,而鈣依賴的分子通路的改變是鉀通道重塑的基礎(chǔ)之一。因此,鉀通道與鈣通道的重塑與心臟肥厚的發(fā)生與發(fā)展有著重要的關(guān)系。但是,目前對(duì)于離子通道和心臟肥厚的關(guān)系的研究大多集中于心肌細(xì)胞,而對(duì)成纖維細(xì)胞離子通道在心臟肥厚的發(fā)生與發(fā)展中是否發(fā)揮作用尚未知曉,有待進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Real-Time PCR的方法研究鉀通道、鈣通道、鈉通道、氯通道和鈉泵在正常成年大鼠

5、和心臟肥厚模型大鼠的心室成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平,通過與正常成年大鼠心室成纖維細(xì)胞的表達(dá)水平的比較,研究這些通道和心臟肥厚發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　 第一部分大鼠心臟肥厚模型的制備以及心臟功能和組織學(xué)評(píng)價(jià)
　　 目的:制備異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)與腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)誘導(dǎo)的心臟肥厚模型。
　　 方法:Iso誘導(dǎo)的心臟肥厚模型:背部皮下注射Iso5mg/(kg-d),連續(xù)七天,即可誘導(dǎo)大鼠心臟肥厚模型;AAC誘導(dǎo)的心

6、臟肥厚模型:成年雄性大鼠常規(guī)1.2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,左側(cè)臥位,于側(cè)腹部作一切口,游離出部分腹主動(dòng)脈,然后用5號(hào)縫合線將自制的彎曲的8號(hào)針頭與腹主動(dòng)脈一并結(jié)扎,再緩緩抽出針頭,造成腹主動(dòng)脈的內(nèi)徑縮窄,最后復(fù)位臟器,縫合腹壁。關(guān)籠飼養(yǎng),四周成模。
　　 結(jié)果:血流動(dòng)力學(xué):與對(duì)照組比較,Iso組LVSP明顯下降(P＜0.01),LVEDP明顯升高(P＜0.01),而±dp/dtmsx明顯下降(P＜0.05);AAC組LVSP明

7、顯上升(P＜0.05),LVEDP明顯升高(P＜0.01),而±dp/dtmsx明顯下降(P＜0.05)。心臟重量指數(shù)(HWI):與對(duì)照組比較,Iso組和AAC組心臟重量及HWI明顯升高(P＜0.01)。病理學(xué)檢查,HE染色,光鏡下可見:對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰,橫紋明顯,無細(xì)胞腫脹;Iso組和AAC組肌纖維排列紊亂,走向不一,呈旋渦狀或簇狀互相交錯(cuò)排列,心肌細(xì)胞顯著肥大。Masson染色,光鏡下可見:對(duì)照組大鼠心肌纖

8、維排列整齊,無細(xì)胞腫脹,無膠原纖維增生;Iso組和AAC組肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞顯著肥大,膠原纖維顯著增生,并且伴有血管壁纖維化現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:經(jīng)過AAC處理和Iso處理的大鼠均能成功誘導(dǎo)出心臟肥厚,其中Iso造模方法相對(duì)簡(jiǎn)單,且周期短,成模率高;AAC模型類似臨床負(fù)荷型心臟肥厚的病理生理學(xué)過程,周期較長(zhǎng)。兩種方法誘導(dǎo)的心臟肥厚模型的成功制備為下一步的實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　 第二部分心臟肥厚和心臟成纖維細(xì)胞中離子通

9、道基因表達(dá)水平的研究
　　 目的:研究正常成年大鼠與心臟肥厚模型組大鼠心室成纖維細(xì)胞中鉀離子通道、鈣離子通道、鈉離子通道以及氯離子通道等的mRNA的表達(dá)水平。
　　 方法:首先使用酶消化法分別原代分離正常成年大鼠和心臟肥厚模型大鼠的心室成纖維細(xì)胞并培養(yǎng)三天,然后按照Trizol法提取總RNA;接著根據(jù)Promega Reverse Transcription System中提供的方法合成cDNA的第一鏈;最后根據(jù)raka

10、ra SYBR Premix Ex TaqTM熒光試劑盒的說明進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析所用的方法為2-△Ct法,其中Ct值為基因進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的循環(huán)數(shù),而△Ct為處理組目的基因的Ct值與對(duì)照組目的基因的Ct值之差。
　　 結(jié)果:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)使用β-actin做為內(nèi)參。在正常組和心臟肥厚組的心室成纖維細(xì)胞中,β-actin的表達(dá)水平未發(fā)生變化(P＞0.05),說明β-actin的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定并

11、不受實(shí)驗(yàn)處理的影響。BNP是一種細(xì)胞因子,在心臟肥厚時(shí)表達(dá)水平會(huì)升高;而α-SMA在成纖維細(xì)胞大量增殖和分化成為肌纖維母細(xì)胞時(shí)表達(dá)水平會(huì)升高。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,BNP和α-SMA在心臟肥厚模型組的心室成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.01)。
　　 2、Kv2.1、Kv4.1和Kv4.2通道m(xù)RNA在心臟肥厚模型的心室成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著升高。Kv1.2通道m(xù)RNA在AAC組中表達(dá)水平顯著降低(P＜0

12、.05),而在Iso組中表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05);Kv1.6通道m(xù)RNA在Iso組中表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),而在AAC組中表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv3.1和Kv4.3通道在各組中的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3、Kir2.2通道m(xù)RNA在心臟肥厚模型的心室成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低,而Kir6.1通道m(xù)RNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。

13、Kir2.1通道m(xù)RNA在AAC組中表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),而在Iso組中表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。Kir3.4和Kir6.2通道在各組中的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4、Nav2.1通道m(xù)RNA在心臟肥厚模型的心室成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01),而Cav3.1通道和Na+-K+-ATPaseβ1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。Nav1.1通道m(xù)RNA在AAC組中表達(dá)

14、水平顯著降低(P＜0.05),而在Iso組中表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05);Cav1.2、CLC-3通道和Na+-K+-ATPaseα1 mRNA在Iso組中表達(dá)水平顯著升高,而在AAC組中表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。Na+-K+-ATPaseα2在各組中的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 5、在心臟肥厚模型組心室成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平相對(duì)于正常水平有較大改變的通道,在正常大鼠心室成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平也相對(duì)