CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞影響的研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是整形外科常見疾病之一,也是尚未解決的問題之一,治療效果多年來沒有顯著的提高。瘢痕疙瘩的發(fā)生具有明顯的個體差異和家族傾向,生物學(xué)特性十分復(fù)雜,其根本形成機(jī)制迄今尚未清楚,是整形外科重要的基礎(chǔ)研究之一。大量的遺傳流行病學(xué)研究和分子遺傳學(xué)研究均表明瘢痕疙瘩的形成與相關(guān)遺傳基因的表達(dá)異常具有非常密切的關(guān)系。既往研究顯示,1號染色體的短臂術(shù)端匯集了許多與細(xì)胞生長,增殖,分化相關(guān)的基因,已有大量報(bào)道在許多腫瘤中該區(qū)存在缺失,其缺失頻率位于

2、36％～80%之間。尋找相關(guān)調(diào)控基因在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用已成為當(dāng)前瘢痕疙瘩研究的熱點(diǎn)之一[1]。因此深入研究以期從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制,篩選出瘢痕疙瘩形成或抑制的相關(guān)調(diào)控基因,為瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)理研究和指導(dǎo)臨床有效的預(yù)防與治療提供線索和依據(jù),具有十分顯著的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 CDC2L1基因是編碼p34Cdc2蛋白激酶家族中的一員。p34Cdc2蛋白激酶家族成員眾所周知調(diào)控真核細(xì)胞周期的要素。CDC2L1基因與CDC

3、2L2基因緊密相鄰,在同一染色體相同區(qū)域上[2,3]。這個基因位點(diǎn)包括CDC2L1基因,CDC2L2基因及金屬蛋白酶MMP21/22,構(gòu)成一個大的重復(fù)基因組兩個相同串聯(lián)連接區(qū)域的一部分。CDC2L1基因和CDC2L2基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤與擴(kuò)增的MYCN基因表現(xiàn)為很高的缺失率或者變異率[4]。在細(xì)胞凋亡中,CDC2L1基因編碼的蛋白激酶能夠被caspase切割開和被修飾而發(fā)揮作用[5-11]。CDC2L1基因的幾個可選擇的剪接變體已經(jīng)被報(bào)告

4、。CDC2L1基因在維持細(xì)胞的細(xì)胞周期控制,凋亡,神經(jīng)生理學(xué),分化和轉(zhuǎn)錄過程中具有重要的功能,通過抑制CDC2Ll基因活性來達(dá)到研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩形成中的作用已成為瘢痕疙瘩基因研究的熱點(diǎn)[12]。目前研究認(rèn)為CDC2L1基因表達(dá)2種蛋白p58和p110,其中最重要的部分是p58蛋白,對CDC2L1基因發(fā)揮其功能是必不可少的,它也可以作為CDC2L1基因活性抑制劑的天然靶位[13]。靶向hCR常用的方法有RNA干擾(RNAi)

5、、反義核苷酸技術(shù)封閉、錘頭狀核酶切割等。其中小干擾RNA(siRNA)更是在哺乳動物細(xì)胞中顯示了強(qiáng)大的、有效的RNA干擾能力,因而化學(xué)合成的21-23核昔酸的siRNA或質(zhì)粒表達(dá)的小發(fā)夾RNA(shRNA)被常規(guī)用于基因沉默研究。科研人員利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)shRNA表達(dá)技術(shù),該shRNAs在體內(nèi)再被加工為siRNAs,這種方式有可能導(dǎo)致有效的、長期的基因沉默。表達(dá)shRNA的質(zhì)粒載體J下被廣泛用于抗病毒、抗腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

6、脂質(zhì)體最常用于體外細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,以后又被用做基因體內(nèi)導(dǎo)入的載體。脂質(zhì)體可以與DNA形成復(fù)合物,保護(hù)DNA不被核酸酶降解,與細(xì)胞膜結(jié)合后形成內(nèi)吞小體,把DNA釋放到細(xì)胞漿。脂質(zhì)體由脂質(zhì)雙分子層組成的封閉囊泡,無毒和無免疫原性,因此成為基因治療、RNAi分子遞送的重要工具,廣泛受到學(xué)者的青睞。
　　 國外研究CDC2L1基因時,所選的對象是腫瘤患者或?qū)嶒?yàn)動物,沒有發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是RT-PCR,SNP分析,

7、基因芯片檢測技術(shù),分子雜交技術(shù),單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析,比較基因組雜交。國內(nèi)雖然有研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用,所采用的技術(shù)是比較基因組雜交技術(shù)(CGH),變性高效液相色譜法結(jié)合測序篩選和鑒定,但由于研究時涉及到多個基因的作用及相互作用,不能體現(xiàn)其中一個基因在瘢痕疙瘩中的作用。鑒于上述原因,本課題選擇利用基因治療策略及方法來研究單個相關(guān)基因(CDC2L1)在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制所起的作用及其意義。
　　 研究目的：
　　

8、 我們運(yùn)用pGPU6/GFP/Neo siRNAExpression Vector構(gòu)建重組質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染來沉默瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的hCR基因表達(dá),以觀察CDC2L1基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞生長的影響,為研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用提供可靠的依據(jù)和有效的手段。
　　 研究方法：
　　 1 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平的測定
　　 通過q-PCR檢測瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和人正常皮膚

9、成纖維細(xì)胞中CDC2L1基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 2 RNAi重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建利用GenePharma公司的siRNA靶序列分析軟件設(shè)計(jì)siRNA靶序列,再根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,選擇針對hCR(GenBank number984)的21nt的序列(CDC2L1-1636,CDC2L1-1813,CDC2L1-1962位堿基)作為特異性siRNA靶序列?；瘜W(xué)合成62nt寡核苷酸和它的互補(bǔ)鏈,退火

10、、連接到BamH1/Bbs I線性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pGPU6-hCR。插入序列采用Bbsl和Pstl酶切和測序的方法來證實(shí)。siRNA的陰性和陽性對照寡核營酸被用來構(gòu)建pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH,,構(gòu)建方法同hCR。該質(zhì)粒也用酶切和測序的方法證實(shí)。
　　 3篩選有效的干擾質(zhì)粒
　　 通過q-PCR檢測所構(gòu)建的重組質(zhì)粒對

11、CDC2L1基因的抑制效率,從而選擇干擾效果較好的重組質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)的干擾靶點(diǎn)進(jìn)行下游研究。
　　 4 RNAi重組質(zhì)粒沉默人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的hCR基因
　　 用RNAi重組質(zhì)粒和對照(pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH質(zhì)粒,脂質(zhì)體)轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,同時設(shè)立對照。繪制生長曲線、Western blot法測定CDC2L1基因的蛋白變化,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。
　　 研究結(jié)果：

12、r>　　 1通過q-PCR檢測證明
　　 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平明顯升高,是人正常皮膚成纖維細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的38.85倍。
　　 2經(jīng)酶切和測序鑒定證明
　　 CDC2L1.shRNA模板成功插入到pGPU6表達(dá)質(zhì)粒中,成功構(gòu)建了3個shRNA表達(dá)質(zhì)粒。
　　 3通過q-PCR鑒定證明
　　 CDC2L1-1636干擾效率為67.33%,siRNA能夠有

13、效降低CDC2L1 mRNA水平,CDC2L1-1813和CDC2L1-1962抑制效率非常低,幾乎沒有抑制效率,從而選擇CDC2L1-1636為試驗(yàn)的干擾靶點(diǎn)進(jìn)行研究。
　　 4 MTT結(jié)果顯示
　　 GPU6-CDC2L1-shRNA-1636質(zhì)粒組較脂質(zhì)體組,pGPU6-shNC對照組和未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞組生長速度有明顯差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(p＜0.05)。Western blot法測定CDC2L1基因的蛋白變化,流

14、式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,與pGPU6-shNC質(zhì)粒對照組、pGPU6-shhGAPDH質(zhì)粒對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組相比,pGPIJ6-CDC2L1-shRNA-1636質(zhì)粒組CDC2L1蛋白表達(dá)水平相應(yīng)下降較明顯,細(xì)胞凋亡數(shù)目增加有明顯的差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平明顯升高,是人正常皮膚成纖維細(xì)胞中