FHL2對(duì)心臟HERG鉀離子通道表達(dá)的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景:由人類果蠅相關(guān)基因――HERG(Humanether-a-go-go-relatedgene)編碼的心臟HERG鉀通道屬于電壓依賴性鉀通道,介導(dǎo)快速激活延遲整流鉀電流(rapidlyactivateddelayedrectifierpotassiumcurrents,Ikr)。HERG基因的突變將導(dǎo)致第二型的長(zhǎng)QT綜合征(longQTsyndrome,LQTS)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)

2、胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾等功能的完成依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。既往的研究表明FHL1通過(guò)與心臟鉀通道相互作用而發(fā)揮調(diào)控該通道所介導(dǎo)電流IKs(theslowlyactivatingcomponentofthedelayedrectifierK+current,IKs)的功能。IKs和Ikr電流都屬于延遲整流鉀電流,是構(gòu)成心臟動(dòng)作電位第3相的主要外向電流,對(duì)心臟復(fù)極發(fā)揮極其重要的作用。而F

3、HL1和FHL2的氨基酸構(gòu)成有著47％的同源性。本實(shí)驗(yàn)的前期工作通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)、GSTpull-down發(fā)現(xiàn)了FHL2與心臟HERG鉀通道存在相互作用。在此基礎(chǔ)之上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究FHL2對(duì)心臟HERG鉀通道表達(dá)的調(diào)控作用,旨在更深刻了解心臟HERG鉀通道的調(diào)控機(jī)理,為L(zhǎng)QTS的治療提供新思路。
　　目的:闡明FHL2對(duì)心臟HERG鉀通道道白表達(dá)水平的調(diào)控作用,進(jìn)一步明確FHL2對(duì)心臟HERG鉀通道功能的影響作用。
　

4、　方法:(1)以PCR法擴(kuò)增FHL2基因的開放閱讀框(openreadingframe,ORF),并分別在其5’端及3’端加上EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn),將其克隆進(jìn)入載體pcDNA3.0構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2。(2)原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng):取出生24h內(nèi)大鼠左心室,剪碎,0.25%胰蛋白酶分離,離心收集心肌細(xì)胞,差速貼壁法和化學(xué)試劑法抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng),純化后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。(3)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcD

5、NA3.0-FHL2、針對(duì)人類FHL2的siRNA分別轉(zhuǎn)染乳鼠原代心肌細(xì)胞。(4)將轉(zhuǎn)染后乳鼠心肌細(xì)胞提取的蛋白用Westernblot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平:分別加入FHL2一抗(鼠來(lái)源)和HERG一抗(羊來(lái)源),驗(yàn)證FHL2對(duì)HERG鉀通道蛋白表達(dá)的影響。(5)FHL2和HERG在HEK-293細(xì)胞的表達(dá):應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-HERG轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,以及將pcDNA3.0-FH

6、L2、pcDNA3.0-HERG共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析,應(yīng)用抗HERG和抗FHL2的抗體顯示HERG及FHL2的細(xì)胞定位。(6)在HEK-293細(xì)胞中,利用膜片鉗技術(shù),研究FHL2對(duì)HERG鉀通道功能的影響。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2,酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果正確。(2)針對(duì)FHL2的siRNA通過(guò)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染乳鼠原代心肌細(xì)胞后,Westernblot檢

7、測(cè)FHL2蛋白的表達(dá)量減少,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2的乳鼠心肌細(xì)胞,Westernblot檢測(cè)FHL2蛋白的表達(dá)量增加。(3)FHL2蛋白抑制表達(dá)時(shí),HERG鉀通道蛋白表達(dá)量減少;FHL2過(guò)度表達(dá)時(shí),HERG鉀通道蛋白表達(dá)量增加。(4)膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在HEK-293細(xì)胞單獨(dú)表達(dá)HERG時(shí),電流為400±30pA,同時(shí)表達(dá)HERG和FHL2時(shí),電流增加到839±44pA,兩組之間進(jìn)行t檢驗(yàn),t=-30.614,p=0.0