桑黃多糖提取純化及活性研究.pdf

1、桑黃是已知生物抗癌領(lǐng)域功效顯著的大型真菌之一,由于過(guò)度開采,桑黃野生資源匱乏,人工栽培技術(shù)尚不成熟,使其成為研究和開發(fā)熱點(diǎn)。桑黃主要功效成分是多糖,多存在于子實(shí)體中,菌絲體中也有一定含量。目前關(guān)于桑黃的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在多糖提取、抗癌機(jī)理及分子結(jié)構(gòu)研究。但桑黃人工栽培還處于實(shí)驗(yàn)室階段,對(duì)于多糖抗癌活性的具體物質(zhì)組成仍在研究中,有關(guān)不同菌種桑黃多糖的差異性研究尚不清楚。本文選用日本桑黃和韓國(guó)桑黃兩個(gè)菌種,采用袋料栽培與液體菌絲發(fā)酵法培養(yǎng)子

2、實(shí)體與菌絲體,通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取和檢測(cè)方法,并采用離子交換柱層析法純化其多糖成分,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行肝癌HepG-2細(xì)胞體外抑瘤試驗(yàn),以探討不同菌種不同純度桑黃多糖的含糖量與抗癌活性差異。
　　 以棉籽殼和麩皮為主料的培養(yǎng)基中,桑黃子實(shí)體正常出菇。其中日本桑黃菌絲生長(zhǎng)13天滿袋,培養(yǎng)41～47天子實(shí)體形成,第80天子實(shí)體成熟即可采摘,平均干重產(chǎn)量可達(dá)29g/袋。而韓國(guó)桑黃菌絲則需17天長(zhǎng)滿袋,培養(yǎng)第28～35天時(shí)子實(shí)體開始

3、形成,第48天子實(shí)體成熟并有孢子彈射,平均干重產(chǎn)量為18g/袋。兩種桑黃子實(shí)體培養(yǎng)條件相同,即:發(fā)菌階段于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng),出菇階段則為白天28℃,夜間18℃,相對(duì)濕度90％～95％,提供散射光,通氣良好(日通風(fēng)3次,每次15min)。液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲球過(guò)程中,根據(jù)菌絲形態(tài)可將發(fā)酵周期分為四個(gè)階段,分別為適應(yīng)期、生長(zhǎng)期、成熟期和衰亡期。一級(jí)種培養(yǎng)7天即可獲得大量小菌絲球,二級(jí)種發(fā)酵5天便可獲得成熟菌絲球,黃綠色,平均干重產(chǎn)量為0.

4、613g/100mL。
　　 熱水回流法提取中以日本桑黃菌絲體粗多糖得率最高,為8.04％,而多糖提取率最高的是日本桑黃子實(shí)體,為4.36％。子實(shí)體多糖提取微波輔助法最佳條件為料液比1:45,功率450W,時(shí)間6.5min,多糖提取率為5.61％;復(fù)合酶法提取最佳條件為料液比1:90,時(shí)間140min,纖維素酶1.1％,木聚糖酶0.45％,β-葡聚糖酶1.25％,果膠酶0.3％,提取率可達(dá)6.82％,
　　 通過(guò)蒽酮-硫

5、酸法與苯酚-硫酸法所測(cè)結(jié)果的比較,選用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量,還原糖含量測(cè)定采用DNS法,蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定,其中總糖含量以日本桑黃子實(shí)體粗多糖最高,為67.24％,還原糖含量則以韓國(guó)桑黃子實(shí)體粗多糖最多,高達(dá)11.02％,蛋白質(zhì)以菌絲粗多糖含量最高,25.95％。多糖穩(wěn)定性檢測(cè)可知,85℃熱水中僅用162秒即可使多糖溶解完全,黑暗條件下多糖含量基本穩(wěn)定,同時(shí),桑黃多糖還具有較好的抗還原性與抗氧化性。
　　

6、 水提所得粗多糖用不同濃度乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉,日本桑黃子實(shí)體多糖80％醇沉多糖的總糖含量高達(dá)69.08％。Sevage法和三氯乙酸法脫蛋白結(jié)果差異明顯,最大脫除率分別為為76.96％和79.23％,最小多糖損失率分別為10.57％和20.71％。對(duì)脫蛋白多糖應(yīng)用纖維素柱層析進(jìn)行初步純化,其中日本桑黃子實(shí)體的純化多糖含糖量及蛋白質(zhì)含量最高,為82.12％和8.53％。采用SePhadexG-100凝膠柱層析對(duì)多糖進(jìn)行再次純化及純度檢驗(yàn),仍以

7、日本桑黃子實(shí)體所得均一多糖中糖含量與蛋白質(zhì)含量最高,分別為87.11％和5.17％。
　　 最后,試驗(yàn)通過(guò)肝癌HepG-2細(xì)胞體外抑制率檢測(cè)各多糖抑瘤率,不同純度多糖其抑瘤效果差異較大:日本桑黃子實(shí)體粗多糖、纖維素柱層析純化多糖及兩次凝膠柱層析均一多糖的癌細(xì)胞抑制率最高分別為51.20％,56.27％和33.87％,菌絲體多糖癌細(xì)胞抑制率最低,分別為35.73％,46.13％及25.87％。
　　 本試驗(yàn)結(jié)果為桑黃這一抗