高原高寒環(huán)境因素對內(nèi)皮細胞的損傷作用及其保護作用化合物研究.pdf

1、研究背景：
　　我國高原面積廣大,且大多處于邊境地區(qū),戰(zhàn)略意義十分重要。高原特殊的地理環(huán)境和地貌特征造成了高原地區(qū)寒冷、低氧雙重脅迫的環(huán)境特點。高原環(huán)境不但損害人體健康,更影響高原部隊平戰(zhàn)時的機動性和作訓能力,因此解決高原官兵健康問題是提高我軍戰(zhàn)斗力的必要環(huán)節(jié)。平原人初入高原時,由于氧氣濃度驟減,機體發(fā)生了一系列的病理性變化,易患高原肺水腫、高原腦水腫,而久居高原的人由于長期缺氧代償反應,易患肺動脈高壓、高原性心臟病,而這些疾病的

2、始動因子是內(nèi)皮細胞的紊亂。另外,在高原高寒的環(huán)境下,野外作業(yè)時間可能引起全身性低體溫(35～28℃),表現(xiàn)為外周血收縮、血液灌流減少、四肢易患凍傷,而此時最先受到損傷的仍是內(nèi)皮細胞。因此保護內(nèi)皮細胞,逆轉內(nèi)皮細胞功能紊亂成為防治高原疾病的新對策。納他卡林(natakalim,Nat)是可高選擇性的激活KATPSUR2B/Kir6.1亞型的先導化合物。前期研究已表明KATP的激活在高原肺水腫、高原腦水腫的防治上具有積極的作用,目前已知納他

3、卡林可以通過逆轉內(nèi)皮功能紊亂從而改善壓力超負荷致心力衰竭,而關于納他卡林對低氧所致的內(nèi)皮細胞損傷的保護作用與保護機制的研究還甚少。因此研究低溫、低氧及復合條件對機體的影響及其機制,并研究新型內(nèi)皮細胞保護藥物對抗低氧損傷的效果及其機理,具有重要的意義。
　　研究目的：
　　研究低溫(28℃)、低氧(3％O2)、低溫低氧復合三種條件下大鼠主動脈內(nèi)皮細胞(rataorticendothelialcells,RAEC)的損傷規(guī)律,用

4、2×2析因分析的方法闡明復合損傷與單因素損傷的區(qū)別及復合條件下的主要影響因素,為進一步認識高原高寒環(huán)境損傷提供理論依據(jù)。另外,針對ATP敏感性鉀通道SUR2B/Kir6.1亞型選擇性開放劑——納他卡林,以急性低氧和高同型半胱氨酸(homocystein,HCY)作為損傷因素,研究藥物的內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制。
　　研究方法：
　　采用主動脈血管片貼壁培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)SPF級雄性Wistar大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞。用MTT法

5、測定細胞存活率、倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),確定低溫損傷的有效作用時間。以21%O2、28℃培養(yǎng)30h為條件,研究低溫對內(nèi)皮細胞的損傷作用;以3%O2、37℃培養(yǎng)30h為條件研究低氧對內(nèi)皮細胞的損傷作用;在研究低溫低氧復合作用時,將內(nèi)皮細胞分為正常對照組(21%O2、37℃)、低溫模型組(21%O2、28℃)、低氧模型組(3%O2、37℃)、復合模型組(3%O2、28℃),同時孵育內(nèi)皮細胞30h。用MTT法測定細胞存活率、硝酸還原酶法檢測一

6、氧化氮(NO)的釋放、RT-PCR法檢測細胞間粘附因子-1(ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)基因的表達水平;Hoechst33258和TUNEL法檢測細胞凋亡;WesternBlot法檢測HIF-1α蛋白表達水平;通過透射電鏡觀察細胞超微結構。用析因分析的方法,闡明復合損傷與單因素損傷的區(qū)別,確定復合條件下的低溫、低氧對內(nèi)皮細胞影響的主次

7、效應。
　　在研究納他卡林對低氧所致RAEC損傷的保護作用中,將細胞分為正常對照組、低氧模型組、納他卡林低、中、高劑量組,格列本脲拮抗組。用MTT法測定細胞存活率、硝酸還原酶法檢測NO的釋放、黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD活力、RT-PCR法檢測ICAM-1、VEGF、ET-1的基因表達水平;ELISA法測定ICAM-1、VEGF蛋白的表達水平。在研究納他卡林對高HCY致RAEC損傷的保護作用中,用Realtime-PCR法檢

8、測血管細胞黏附因子(VCAM-1)、單核細胞趨化因子(MCP-1)和ICAM-1基因的表達水平。
　　研究結果：
　　1.血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　采用主動脈血管片貼壁的方法,培養(yǎng)出大鼠主動脈內(nèi)皮細胞,經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,內(nèi)皮細胞陽性率98%以上。
　　2.寒冷對血管內(nèi)皮細胞的影響
　　根據(jù)細胞存活率的測定和形態(tài)學的觀察,確定30h為低溫損傷的有效作用時間,因此將28℃孵育細胞30h作為研究低體溫損

9、傷的體外模型。研究發(fā)現(xiàn)低溫具有明顯的降低細胞增殖率,抑制細胞NO釋放的作用,此外,低溫在細胞凋亡和通透性方面具有一定的抑制作用,而在炎性因子的釋放、內(nèi)皮素基因表達方面有一定的促進作用,低溫時可見細胞內(nèi)質網(wǎng)發(fā)生擴張,呈大泡狀。
　　3.高原低氧對內(nèi)皮細胞的影響
　　低氧可促進細胞凋亡、抑制NO釋放,增強炎性因子和內(nèi)皮素基因表達,可導致血管通透性增高,HIF-1α表達量增多,低氧時細胞超微結構的改變表現(xiàn)為線粒體腫脹、斷裂,質膜小

10、泡增多。
　　4.低溫低氧復合因素對內(nèi)皮細胞的影響
　　低溫低氧復合因素在細胞存活率、內(nèi)皮活性因子的釋放(NO、ET-1)、炎性因子表達、HIF-1α蛋白表達、細胞凋亡、細胞器變化方面存在著交互作用,在通透性方面沒有交互作用。具體表現(xiàn)為:當內(nèi)皮細胞長至60%后進行干預,復合組細胞存活率與對照組、低溫組、低氧組相比均有所下降,低溫低氧對細胞存活率的影響具有正交互效應,在復合條件下低溫為主要因素,對細胞存活率的影響更為顯著。當內(nèi)

11、皮細胞長至100%后進行干預,復合組的細胞存活率與對照組、低溫組相比有所降低,但與低氧組相比略有升高,低溫低氧對細胞存活率的影響無交互效應,在復合條件下僅低氧對細胞存活率的具有顯著性影響。在NO釋放方面,復合組的細胞NO的釋放量與對照組、低溫組、低氧組相比均有大幅下降,低溫低氧對細胞NO的釋放量的影響具有正交互效應,在復合條件下低溫為主要因素,對細胞NO釋放量的影響更為顯著。在細胞凋亡方面,低氧和復合條件下,均有細胞凋亡現(xiàn)象,且復合組比

12、低氧組凋亡細胞少;提示在復合條件下,低溫低氧具有負交互效應,低氧為主要影響因素,低溫對細胞凋亡具有一定的保護作用。在炎性因子表達方面,復合組的細胞ICAM-1mRNA的表達量與對照組、低溫組相比均有所升高,但比低氧組的表達量低,低溫低氧對細胞ICAM-1基因表達的影響具有負交互效應,在復合條件下低氧為主要因素,對細胞炎性因子表達的影響更為顯著。在細胞通透性方面,復合組的細胞VEGFmRNA的表達量與對照組、低溫組相比顯著性升高,比低氧組

13、的表達量顯著降低,低溫低氧對細胞VEGF基因表達的影響無顯著性交互效應,在復合條件下低氧為主要因素,對細胞VEGF基因表達具有極顯著的影響。在ET-1基因表達方面,復合組的細胞ET-1mRNA的表達量與對照組、低溫組相比均有所升高,但比低氧組的表達量低,低溫低氧對細胞ET-1基因表達的影響具有負交互效應,在復合條件下低氧為主要因素,對細胞ET-1基因表達的影響更為顯著。在低氧誘導因子(HIF-1α)的表達方面,復合組細胞HIF-1α蛋白

14、表達量與對照組、低溫組相比極顯著性升高,與低氧組相比略有降低,低溫低氧對細胞HIF-1α蛋白的表達量的影響具有負交互效應,在復合條件下低氧為主要因素,對細胞HIF-1α蛋白表達的影響更為顯著。在細胞超微結構方面,低溫低氧復合條件出現(xiàn)了線粒體發(fā)腫脹、斷裂,內(nèi)質網(wǎng)擴張等超微結構的損傷,與單因素損傷相比具有一定的加成作用。
　　總之在復合損傷中,低溫在細胞增殖力和NO釋放量方面為主要影響因素,與低氧復合具有正交互作用。低氧在細胞凋亡、炎

15、性因子的釋放、通透性改變、HIF-1α的表達方面為主要影響因素,低溫低氧復合時具有拮抗作用,即低溫具有一定的低氧損傷保護作用。
　　5.納他卡林對低氧致內(nèi)皮細胞損傷的保護作用
　　氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細胞24h,與對照組相比細胞存活率降低了22.3%,NO釋放量下降了39.9%,SOD活力降低了61.8%,ICAM-1、ET-1、VEGF基因表達量均顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01);低氧干預12h后ICAM-

16、1、VEGF蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01)。0.1、1、10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細胞孵育8h,在氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細胞24h后,與模型組相比,納他卡林三個劑量組均可逆轉低氧所致的血管內(nèi)皮細胞功能改變,包括提高內(nèi)皮細胞生存活力和NO的釋放水平、增強SOD活力、顯著抑制低氧所致ICAM-1、ET-1、VEGF基因過度表達(P<0.05,P<0.01)及ICAM-1、VEGF蛋白的高表達(P<0.05,P<

17、0.01)。使用格列本脲作為拮抗劑預孵育內(nèi)皮細胞6h,再用10μmol/L納他卡林孵育8h后,置于氧濃度為3%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,在細胞存活率、NO的釋放和SOD活性方面,格列本脲可顯著逆轉納他卡林的保護作用(P<0.01)。
　　6.納他卡林對高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細胞損傷的保護作用
　　0.1mmol/L同型半胱氨酸孵育大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞6h,與正常對照組相比,VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因表達水平均顯著上

18、調(diào)。0.001,0.01,0.1,1,10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細胞共孵育8h,再給予0.1mmol/LHCY孵育6h后,與模型組相比,0.001～10μmol/L納他卡林均可顯著抑制高同型半胱氨酸所致VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因過度表達,但未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應,0.001μmol/L納他卡林即可對高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細胞炎性因子的過度表達起到抑制作用,說明納他卡林具有強效的內(nèi)皮保護效果。
　　結論：

19、　　低溫低氧復合損傷與單因素損傷不同,在細胞增殖、NO釋放、炎癥因子表達、內(nèi)皮素基因表達、細胞凋亡、HIF-1α蛋白表達方面具有交互效應,在VEGF基因方面無交互作用。低溫低氧復合在抑制細胞增殖、抑制NO的釋放方面具有正交互效應,而在炎性因子表達、ET-1基因表達、細胞凋亡、HIF-1α蛋白表達方面,具有負交互效應,即低溫對低氧損傷起到了一定的保護作用。以KATP為靶點的先導化合物納他卡林可逆轉低氧及高同型半胱氨酸誘導的內(nèi)皮細胞功能紊亂