乙醛脫氫酶2在乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 大量流行病學(xué)資料表明，適量飲酒有保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用，可降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，coronaryarterydisease，CAD）的發(fā)生率及病死率。早期研究多認(rèn)為酒中的非乙醇活性成分起到了重要作用，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)心血管系統(tǒng)起主要保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，低劑量乙醇可通過(guò)激活腺苷受體依賴的PI3K-Akt通路增強(qiáng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(edothelialnitricoxidesynt

2、hase，eNOS)的表達(dá)及活性，并增加一氧化氮(nitricoxide，NO)生成及釋放。
　　 然而，乙醇作為一種外源性的小分子有機(jī)化合物，可通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，經(jīng)由酒精代謝系統(tǒng)進(jìn)行代謝時(shí)可伴隨產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)。活性氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS有雙面作用，并取決于ROS的水平。大量活性氧可通過(guò)eNOS脫偶聯(lián)或者拮抗其上游調(diào)節(jié)分子來(lái)抑制eNOS活性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂;而少

3、量活性氧可以增強(qiáng)eNOS的活性。而在乙醇干預(yù)時(shí)的ROS水平取決于抗氧化體系的拮抗作用。
　　 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2不僅代謝乙醛，還可通過(guò)氧化丙二醛(malondialdehyde，MDA)和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）等毒性醛類物質(zhì)來(lái)發(fā)揮間接抗氧化作用，拮抗ROS生成。多項(xiàng)研究結(jié)果表明調(diào)控ALDH2表達(dá)和活性可以影響機(jī)體細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)答。ALDH2活性可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)與修飾、翻譯和翻

4、譯后修飾不同水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。尤其是，ALDH2活性可受乙?；揎椀恼{(diào)控，其可被線粒體SIRT3直接脫乙?；鴮?dǎo)致酶活性下降。
　　 SIRT3具有依賴NAD+的組蛋白脫乙?；富钚?，位于線粒體基質(zhì)中，可以通過(guò)調(diào)控線粒體蛋白乙?；接|發(fā)一系列細(xì)胞適應(yīng)性改變來(lái)應(yīng)答代謝應(yīng)激。SIRT3活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH比值變化十分敏感，呈正相關(guān)。有意思的是，乙醇代謝會(huì)導(dǎo)致NAD+/NADH比值下降，因此很有可能抑制SIRT3活性。

5、>　　 因此，我們提出以下假說(shuō):乙醇可通過(guò)增強(qiáng)ALDH2酶活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而影響乙醇增強(qiáng)eNOS活性的作用;且SIRT3依賴的乙?；揎椬饔每赡軈⑴c乙醇對(duì)ALDH2活性的調(diào)控過(guò)程。依賴于SIRT3的ALDH2乙?；揎椏赡苁且掖急Ｗo(hù)作用的重要機(jī)制，是防治動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病的新靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanaortice

6、ndothelialcells，HAECs)，使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80-90％時(shí)，用不同濃度的乙醇刺激不同時(shí)間;用PI3K抑制劑或外源性NAD預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，先用試劑預(yù)處理細(xì)胞24小時(shí)后，再用乙醇繼續(xù)孵育30分鐘;
　　 2.siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:用特異性siRNA對(duì)細(xì)胞ALDH2和SIRT3進(jìn)行抑制，用構(gòu)建好的SIRT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒提高細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)。首先用脂質(zhì)體與siRNA/質(zhì)粒形成復(fù)合物，后轉(zhuǎn)染入

7、HAECs。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用/不用ROS清除劑預(yù)處理后，再加入乙醇繼續(xù)孵育;
　　 3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè):使用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后使用SYBRGreen進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-△△ct計(jì)算。
　　 4.Westernblotting檢測(cè):使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用Westernblotting檢測(cè)方法從蛋白水平檢測(cè)用于檢測(cè)HAECs中ALDH2、eNO

8、S、p-eNOS、Akt、p-Akt、PI3K、SIRT3、4-HNE等蛋白的表達(dá)量。
　　 5.免疫共沉淀:用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，加入抗體和蛋白A/G瓊脂糖吸附球共同孵育4℃過(guò)夜進(jìn)行免疫沉淀，高速離心將瓊脂糖球去除并吸取上清液進(jìn)行后續(xù)Westernblotting檢測(cè)。
　　 6.內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性檢測(cè):應(yīng)用eNOS檢測(cè)試劑盒來(lái)分析細(xì)胞eNOS的活性，在激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515nm下進(jìn)行吸光度測(cè)量。eNO

9、S相對(duì)活性用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的活性比值來(lái)表示。
　　 7.線粒體ALDH2酶活性檢測(cè):提取細(xì)胞線粒體，線粒體ALDH2活性是通過(guò)在酶標(biāo)儀上監(jiān)測(cè)A340nm下NAD+轉(zhuǎn)化為NADH的含量變化所得。ALDH2酶活性單位為nmol/mg/min。
　　 8.線粒體SIRT3活性檢測(cè):采用SIRT3活性熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，在激發(fā)光340nm和發(fā)射光440nm檢測(cè)熒光值。SIRT3相對(duì)活性是實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的活性比值來(lái)表示。

10、>　　 9.細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè):應(yīng)用DCFH-DA熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇進(jìn)行標(biāo)記，后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。
　　 10.線粒體NAD+/NADH比值檢測(cè):細(xì)胞收集后提取線粒體，采用NAD+/NADH比值檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，分別在450nm處讀取NADt和NADH數(shù)值。NAD+/NADH比值計(jì)算式為:[NADt-NADH]/NADH。
　　 結(jié)果：
　　 1.乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性的作用呈劑量依賴性:在

11、不同濃度乙醇處理細(xì)胞30min后，隨乙醇濃度增加，內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性逐漸升高，在20mM乙醇作用下達(dá)到最高峰（1.67倍，P＜0.001），而后隨乙醇濃度增加eNOS活性逐漸下降，至100mM乙醇作用時(shí)回到基線水平。乙醇對(duì)eNOS活性調(diào)控呈時(shí)間依賴性:在乙醇作用5min后，內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性即開始升高，在30min后達(dá)最大值，之后逐漸下降，且在乙醇作用120min后，內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性仍然顯著高于對(duì)照組(P＜0.001);

12、　　 2.20mM乙醇作用30min后可使p-eNOS和p-Akt蛋白表達(dá)明顯增加，與乙醇對(duì)eNOS活性的作用趨勢(shì)一致，且乙醇的這一作用可被PI3K抑制劑拮抗，提示乙醇是通過(guò)激活PI3K/Akt通路提高內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性的;
　　 3.ALDH2的活性在乙醇刺激下呈時(shí)間依賴性改變:乙醇處理后15min，內(nèi)皮細(xì)胞ALDH2活性即開始明顯增加，并在30min達(dá)到最大值(1.65倍，P＜0.001)，但隨后即迅速下降，但對(duì)ALDH

13、2mRNA和蛋白表達(dá)沒(méi)有影響;
　　 4.ALDH2siRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞ALDH2表達(dá)后，可拮抗乙醇增加Akt和eNOS活性的作用;
　　 5.20mM乙醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量沒(méi)有影響。而在ALDH2siRNA預(yù)孵育的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，乙醇干預(yù)細(xì)胞后ROS含量明顯升高66％。且ROS清除劑(NAC和DTT)可拮抗ALDH2siRNA對(duì)乙醇內(nèi)皮保護(hù)的抑制作用;
　　 6.乙?；疉LDH2蛋白表達(dá)變化與乙醇刺激呈時(shí)間依賴性

14、。乙醇處理后15min，內(nèi)皮細(xì)胞乙?；疉LDH2蛋白表達(dá)即開始明顯增加，并在30min達(dá)到峰值(P＜0.001)，但隨后即明顯下降，與ALDH2活性變化趨勢(shì)一致;
　　 7.20mM乙醇處理15min后SIRT3活性即下降，在30min時(shí)下降最為明顯，然后隨時(shí)間增加又逐漸恢復(fù)到基線水平。且過(guò)表達(dá)SIRT3可以抵抗乙醇上調(diào)ALDH2乙?；突钚缘淖饔?
　　 8.SIRT3過(guò)表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞受乙醇刺激后，ROS水平明顯增加。

15、且乙醇激活A(yù)kt和eNOS的作用也被SIRT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒所抑制;
　　 9.乙醇處理內(nèi)皮細(xì)胞15min后NAD+/NADH比值顯著下降，在30min時(shí)下降達(dá)最低值。外源性NAD干預(yù)下，乙醇抑制SIRT3活性的作用明顯減弱，且可抑制乙醇上調(diào)ALDH2和eNOS活性的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.乙醇通過(guò)激活PI3K-Akt通路提高eNOS活性;
　　 2.乙醇可上調(diào)ALDH2活性;
　　 3.AL