脂聯(lián)素對內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察脂聯(lián)素對氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)氧化損傷的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離出人外周血單個核細(xì)胞(MNC),以5×106個/cm2密度接種細(xì)胞到事先包被纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板中,每孔加入含有10％胎牛血清并添加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(終濃度均為10ng/ml)及雙抗(青霉素100u/ml,鏈霉素10

2、0u/ml)的M199培養(yǎng)液1ml。培養(yǎng)3天后,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去未貼壁細(xì)胞,得到的貼壁細(xì)胞繼續(xù)原條件培養(yǎng)。培養(yǎng)至第6天,收集貼壁細(xì)胞用不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,隨機(jī)分成5組:正常對照組,氧化低密度脂蛋白組(含10 ug·mL-1Ox-LDL)、Ox-LDL+脂聯(lián)素(1.25 ug·mL-1)、Ox-LDL+脂聯(lián)素(2.5 ug·mL-1)、0x-LDL+脂聯(lián)素(5 ug·mL-1)。采用流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)細(xì)

3、胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2、AC133的表達(dá)及Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化來證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)皮屬性,觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征以鑒定EPCs。干預(yù)24 h后,采用細(xì)胞活力噻唑藍(lán)(MTT)法測定觀察EPCs的活力；并取各組細(xì)胞上清液用SOD、MDA試劑盒進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量檢測。
　　 結(jié)果:
　　 培養(yǎng)3d后的人外周血單個核細(xì)胞呈典型的內(nèi)皮細(xì)胞樣集落。培養(yǎng)6 d后流式細(xì)胞儀分析

4、示CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及AC133陽性細(xì)胞比例分別為65.09％±11.89％、44.69％±9.74％、30.46％±9.23％與19.68％±0.81％。CD34、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為41.67％±10.18％,VEGFR-2、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為28.19％±14.85％,CD34、AC133雙陽性細(xì)胞比例為18.67％±1.27％,VEGFR-2、AC133雙陽性細(xì)

5、胞比例為15.10％±7.42％。培養(yǎng)兩周后,Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽性,胞質(zhì)呈棕色,空白對照及陰性對照不顯棕色。
　　 人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞與Ox-LDL共同孵育24h后,細(xì)胞存活率明顯低于正常組(P＜0.01),與Ox-LDL損傷組比較,脂聯(lián)素各組的細(xì)胞存活率顯著升高(P＜0.01)。與正常組比較,Ox-LDL損傷組的上清液SOD含量(U/ml)明顯降低(P<0.01),MDA含量(nmol/ml)明顯升高(P<0.01),在

6、脂聯(lián)素不同濃度與Ox-LDL,共同干預(yù)24h后,與單純Ox-LDL刺激組比較,上清液SOD含量明顯增高(P<0.01),里明顯的劑量依賴性(P<0.05)。同時脂聯(lián)素各組的上清液MDA含量較Ox-LDL組明顯降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 10μmol/L濃度的Ox-LDL能誘導(dǎo)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與氧化損傷有關(guān)。
　　 脂聯(lián)素對Ox-LDL誘導(dǎo)的EPCs氧化損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制