水通道蛋白5促進(jìn)肺癌增殖遷移及參與肺上皮屏障的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：水通道蛋白5促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲遷移的體外實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究
　　目的：通過建立穩(wěn)定高表達(dá)水通道蛋白5(Aquaporin5，AQP5)的肺癌細(xì)胞株(SPC-A1和PC-9)，觀察不同表達(dá)水平的AQP5對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移作用的影響，進(jìn)一步探討AQP5在肺癌發(fā)生和進(jìn)展中的潛在作用。
　　方法：構(gòu)建MQP5質(zhì)粒，經(jīng)過測序和基因鑒定。通過陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine2000，L2000)介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并利用G

2、418(Geneticin)篩選后，建立穩(wěn)定高表達(dá)AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌細(xì)胞株及相對應(yīng)的空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株作為對照組。應(yīng)用real-time PCR和western blot方法及免疫細(xì)胞熒光法檢測AQP5的表達(dá)。另外，選擇顯著表達(dá)AQP5的肺癌細(xì)胞株(LTEP-A2)，通過siRNA基因干擾下調(diào)AQP5表達(dá)水平，應(yīng)用real-time PCR和western blot方法評價(jià)siRNA對AQP5的干擾下調(diào)效果。進(jìn)一

3、步檢測細(xì)胞水通透性以鑒定穩(wěn)定表達(dá)的AQP5的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能。通過細(xì)胞遷移、侵襲、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞克隆形成等體外實(shí)驗(yàn)，以及進(jìn)行細(xì)胞生長曲線分析，觀察不同AQP5表達(dá)水平對肺癌細(xì)胞體外遷移侵襲特性的影響。
　　結(jié)果：利用G418篩選后，建立了穩(wěn)定高表達(dá)AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌細(xì)胞株及相對應(yīng)的空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞株，應(yīng)用real-time PCR和westem blot及免疫熒光法檢測，表明AQP5細(xì)胞株具有穩(wěn)定的AQP5

4、高表達(dá)。體外研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高表達(dá)AQP5的細(xì)胞株具有顯著增強(qiáng)的細(xì)胞遷移侵襲及細(xì)胞劃痕愈合能力(p<0.01)，但細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞生長曲線分析未顯示顯著差異性(p>0.05)。而siRNA基因干擾下調(diào)AQP5表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲及細(xì)胞劃痕愈合能力顯著下降(p<0.01)。體外研究還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)AQP5細(xì)胞株促進(jìn)細(xì)胞的MUC5AC粘蛋白的表達(dá)。與對照組比較，高表達(dá)AQP5明顯增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的EGFR/ERK1/2/p3

5、8MAPK信號(hào)通路的活性。
　　結(jié)論：AQP5表達(dá)促進(jìn)體外肺癌細(xì)胞侵襲遷移作用，EGFR/ERK/p38 MAPK信號(hào)通路可能在該機(jī)制中發(fā)揮一定的作用，但該作用效應(yīng)是AQP5介導(dǎo)的直接作用還是間接作用有待進(jìn)一步研究。
　　第二部分：水通道蛋白5促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究
　　目的：利用第一部分研究已經(jīng)建立穩(wěn)定高表達(dá)AQP5的SPC-A1肺癌細(xì)胞株，通過建立體內(nèi)腫瘤模型，探討不同表達(dá)水平的AQP5對肺

6、癌細(xì)胞體內(nèi)侵襲遷移及增殖作用的影響。
　　方法：選擇同齡、同性及體重匹配的裸鼠，分別應(yīng)用1×106 SPC-A1細(xì)胞(包括空白質(zhì)粒對照組和AQP5高表達(dá)組)經(jīng)尾靜脈注射制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型，進(jìn)一步根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)分組，制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型。分別在注射不同的時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、6周)處理各組小鼠，取整體肺組織，通過在體熒光成像系統(tǒng)觀察肺癌細(xì)胞在肺部的遷移侵襲。制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型后的2w、4w、6w，分別處理各組部分小鼠，

7、收集肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色病理觀察或冰凍切片后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察肺癌細(xì)胞的肺部侵襲轉(zhuǎn)移情況；進(jìn)一步應(yīng)用AQP5免疫細(xì)胞熒光染色方法觀察鑒定AQP5的蛋白表達(dá)；肺組織固定、切片及HE染色后計(jì)數(shù)分析肺轉(zhuǎn)移瘤情況。另一組實(shí)驗(yàn)：同樣選擇同齡、同性及體重相匹配的裸鼠，制作皮下成瘤模型：專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)用106 SPC-A1細(xì)胞(包括空白對照組和AQP5高表達(dá)組)經(jīng)小鼠背部皮下注射后，應(yīng)用游標(biāo)卡尺，每隔3天計(jì)算檢測瘤塊長(L)、寬(W)，

8、動(dòng)態(tài)監(jiān)測成瘤大小(0.52xLxW2)，共30天。不同時(shí)間點(diǎn)將相應(yīng)的模型小鼠應(yīng)用在體熒光成像系統(tǒng)觀察皮下瘤塊生長情況，30天后處死小鼠，收集瘤塊組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色、病理觀察或冰凍切片后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。并應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步檢測。此外，進(jìn)一步觀察不同的AQP5表達(dá)水平對MUC5AC粘蛋白及與腫瘤生長密切相關(guān)的兩個(gè)重要指標(biāo)PCNA、c-myc表達(dá)的影響。還有，因小鼠肺部均顯著表達(dá)AQP5、AQP1及AQP3

9、，故進(jìn)一步選擇野生型及相對應(yīng)的種群-致的AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠，檢測AQP5、AQP1及AQP3基因敲除對小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號(hào)通路活性的影響。結(jié)果：制作小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤模型后，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)(2W、4W、6W)通過在體熒光成像系統(tǒng)觀察。與對照組比較，高表達(dá)AQP5顯著促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移瘤形成和肺癌細(xì)胞的侵襲和分布。病理觀察還發(fā)現(xiàn)：AQP5高表達(dá)組的SPC-A1肺癌細(xì)胞具

10、有顯著的向外周侵襲特點(diǎn)：更多分布在腫瘤邊緣；而對照組的SPC-A1肺癌細(xì)胞則多呈彌漫性分布。免疫細(xì)胞熒光染色進(jìn)一步明確顯示穩(wěn)定篩選的AQP5高表達(dá)細(xì)胞在體內(nèi)高表達(dá)AQP5。此外，皮下成瘤模型實(shí)驗(yàn)顯示：皮下成瘤后2周，AQP5高表達(dá)組的瘤塊體積顯著大于對照組，兩組間具有顯著差異性(p<0.05)，而4周時(shí)AQP5高表達(dá)組的瘤塊體積小于對照組。結(jié)合病理觀察結(jié)果：腫瘤形成晚期(4周后)，AQP5高表達(dá)組的瘤塊中心具有更顯著的壞死區(qū)，考慮原因可

11、能是因?yàn)槠涓鼜?qiáng)的增殖速度所致，中心更顯著的壞死反而影響了整體瘤塊的增大。免疫組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色顯示：體內(nèi)AQP5高表達(dá)促進(jìn)腫瘤組織MUC5AC粘蛋白及PCNA、c-myc的表達(dá)。進(jìn)一步選擇野生型及AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)AQP5基因敲除顯著下調(diào)了小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的活性；而AQP1及AQP3基因敲除對小鼠肺組織EGFR/ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的活性未發(fā)現(xiàn)

12、有顯著影響。
　　結(jié)論：本部分體內(nèi)研究進(jìn)一步表明了高表達(dá)AQP5的促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲遷移及增殖作用，活性增強(qiáng)的EGFR/ERK/p38 MAPK信號(hào)通路及增強(qiáng)的MUC5AC粘蛋白表達(dá)可能在該機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。
　　第三部分：水通道蛋白5基因敲除對肺部細(xì)菌感染的影響及機(jī)制研究
　　目的：利用AQP5基因敲除小鼠(AQP5-/-)及種群相匹配的野生型小鼠(AQP5+/+)作為對照組，制作銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)(P.ae

13、ruginosa，PA)感染的小鼠肺炎模型，探討在細(xì)菌感染時(shí)，AQP5基因表達(dá)對氣道及肺泡上皮屏障功能及肺部細(xì)菌的清除作用的影響。
　　方法：選擇野生型(AQP5+/+)及AQP5基因敲除(AQP5-/-)小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分為(AQP5+/+)、(AQP5-/-)組。通過氣道滴入法(1x10^6cfu P.aeruginosa)制作急性肺部細(xì)菌感染小鼠模型。分別在感染后2小時(shí)、6小時(shí)處死小鼠，取肺泡灌洗液、血漿、并留取肺組織。

14、血液及肺組織細(xì)菌培養(yǎng)檢測；分類計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BAL)中的細(xì)胞，檢測BAL的蛋白濃度、肺伊文思藍(lán)(EBD)含量檢測反映肺泡毛細(xì)血管通透性。檢測濕干重比值(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)活性；檢測MCP-1、MIP-2、TNF-α等細(xì)胞趨化因子及細(xì)胞因子含量；觀察肺組織病理。酶譜法檢測MMP9、MMP2蛋白活性。檢測AQP5基因敲除對肺組織p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性的影響。體外分離培養(yǎng)AQP5+/+及AQP5-/-小鼠的氣道

15、上皮細(xì)胞，應(yīng)用transwell細(xì)胞培養(yǎng)板制作氣液界面模型(Air-liquid interface，ALI)，進(jìn)一步觀察AQP5基因敲除對氣液界面表面液體層厚度的影響。
　　結(jié)果：在肺部綠膿感染小鼠模型的感染早期，AQP5基因敲除顯著增加了細(xì)菌血液播散程度。降低了中性粒細(xì)胞在遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔的募集，與野生組比較，AQP5基因敲除后PA感染早期的小鼠肺髓過氧化物酶(MPO)活性顯著降低，AQP5基因敲除降低了血MCP-1、MIP-

16、2的表達(dá)水平。在PA感染后4h，與AQP5+/+小鼠組比，在AQP5-/-小鼠肺泡灌洗液(BAL)的蛋白濃度、以及用來評價(jià)肺泡毛細(xì)血管通透性的伊文思藍(lán)(EBD)含量、濕干重比值(W/D)顯著增加。在AQP5-/-組小鼠，MMP9活性在感染后4、6h表現(xiàn)出更為顯著的激活；但在實(shí)驗(yàn)各組均沒有觀察到MMP2活性的明顯變化。AQP5基因敲除減少了肺粘蛋白MUC5AC、MUC5B的mRNA表達(dá)。AQP5基因敲除還顯著降低了肺組織的p38 MAPK