海水淹溺肺損傷肺水通道蛋白1、5的表達(dá)及意義的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、海水淹溺不僅是航海事故、海上生產(chǎn)作業(yè)、旅游的死亡原因之一，而且是軍隊(duì)海上訓(xùn)練、作戰(zhàn)、搶灘登陸戰(zhàn)斗和非戰(zhàn)斗減員的重要原因。水運(yùn)交通事故，潛水等水上運(yùn)動(dòng)引起的淹溺在沿海地區(qū)更為常見(jiàn)。海水吸入肺內(nèi)，可以直接損傷肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可以激發(fā)肺部急性炎癥反應(yīng)，引起肺水腫，急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)主要介導(dǎo)自由水跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境

2、的穩(wěn)態(tài)平衡起重要作用，也參與執(zhí)行機(jī)體的一些重要生理功能。水通道蛋白(AQPs)在肺泡毛細(xì)血管間的水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，在調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞的液體清除中已受到高度重視。AQPs與肺組織液體轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，在肺水平衡調(diào)節(jié)上有重要作用。但是水通道蛋白在海水淹溺性肺損傷中的作用仍不甚清楚，在海水引起的肺損傷中，AQP1，5有什么變化，起什么作用，這方面的研究也較少。為此，在本研究中，我們以海水浸泡A549細(xì)胞和海水淹溺性肺損傷大鼠動(dòng)物模型為研究

3、對(duì)象，觀察AQP1，5在A549細(xì)胞內(nèi)和肺組織的表達(dá)情況，以及地塞米松干預(yù)后的變化規(guī)律，同時(shí)觀察肺組織的炎癥反應(yīng)的變化規(guī)律，旨在探討海水型急性肺損傷(SW-ALI)/海水型呼吸窘迫綜合征(SW-RDS)狀態(tài)下，肺組織內(nèi)AQP1，5的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其在肺水腫中的作用。 研究?jī)?nèi)容： 1.應(yīng)用MTT法、光鏡、免疫熒光和PT-PCR法檢測(cè)海水對(duì)肺腺癌系細(xì)胞A549生長(zhǎng)曲線、生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞形態(tài)的影響及AQP1和AQP5在mRNA

4、和蛋白水平的表達(dá)情況。 2.130只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，即海水淹溺組(n=60)、地塞米松處理組(n=10)和對(duì)照組(n=60)。海水淹溺組大鼠行氣管切開(kāi)、插管、吸入海水法建立；對(duì)照組大鼠只行氣管切開(kāi)，氣管插管；地塞米松處理組大鼠，吸入海水同時(shí)給予腹腔內(nèi)注射地塞米松(1mg/kg)。各組大鼠分別于致傷后0.5h、1h、2h、4h、8h時(shí)間點(diǎn)，取大鼠頸動(dòng)脈血做血?dú)夥治鲇^察動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)的變化；光鏡下觀察

5、肺組織病理變化；ELISA法測(cè)定外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的含量；伊文思蘭法測(cè)定肺組織通透性變化。 3.分別采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR方法檢測(cè)肺組織中AQP1，5表達(dá)與蛋白分布。 結(jié)果： 1.肺腺癌細(xì)胞A549經(jīng)海水浸泡15分鐘后光鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞變小，但未見(jiàn)到細(xì)胞器及胞膜破裂。海水浸泡(1，2，4，8，16min)后，24小時(shí)內(nèi)A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，但24

6、小時(shí)后兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 2.海水浸泡組A549細(xì)胞AQP1在mRNA和蛋白水平表達(dá)(0.78±0.07，27.3±2.7)明顯高于對(duì)照組(0.41±0.04，18.6±1.5)(P＜0.01；P＜0.05)。 3.A549細(xì)胞AQP5mRNA和蛋白的表達(dá)海水浸泡組(0.53±0.06，36.9±4.4)明顯高于對(duì)照組(1.07±0.13，51.3±6.2)(P＜0.01；P＜0.05)。 4.海

7、水吸入后，大鼠動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和PaO2/FiO2迅速下降，0.5小時(shí)時(shí)下降最為明顯(42.4±6.4，202.2±30.5)，以后逐步上升，各時(shí)相點(diǎn)(0.5，1，2，4，8h)海水吸入組明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)；PaCO2僅在0.5h時(shí)有輕度增高(43.1±4.2)；HCO3下降迅速，在2h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)(8.3±4.6)；pH在1h時(shí)下降到最低點(diǎn)(7.13±0.03)。 5.光鏡下可見(jiàn)海水淹溺組大鼠各時(shí)點(diǎn)肺組織有

8、毛細(xì)血管充血、肺間隔增寬、肺間質(zhì)、肺泡水腫和灶性出血，肺泡腔可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，8小時(shí)組最為明顯，對(duì)照組未見(jiàn)明顯病理變化。 6.大鼠外周血TNF-α，在吸入海水后迅速增加，1小時(shí)即達(dá)到328.23±34.68pg/ml，2小時(shí)340.24±30.25pg/ml，之后逐步下降，海水吸入組各時(shí)相點(diǎn)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 7.大鼠外周血IL-6，在吸入海水后逐步增加，在8小時(shí)達(dá)最大(1106.4±180.6pg/ml)。

9、海水吸入組各時(shí)相點(diǎn)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 8.大鼠肺毛細(xì)血管通透性海水吸入后明顯增大(30.7±2.9μg/ml)，顯著高于對(duì)照組(18.4±1.7μg/ml)(P＜0.01)。 9.大鼠肺濕/干比值(W/D)吸入海水后明顯增大，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)逐步增加，8小時(shí)時(shí)最高(5.86±0.43)，與相應(yīng)時(shí)相對(duì)照組(4.46±0.37)比較有顯著差異(P＜0.01)。 10.海水淹溺組及對(duì)照組大鼠肺間質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)

10、皮AQP1均呈陽(yáng)性表達(dá)；但海水淹溺組表達(dá)更強(qiáng)，光密度積分值顯著高于對(duì)照組的表達(dá)(P＜0.05)；海水淹溺組大鼠肺組織AQP1mRNA表達(dá)也顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。 11.海水淹溺組大鼠肺實(shí)質(zhì)AQP5的陽(yáng)性表達(dá)，積分光密度值顯著高于對(duì)照組的表達(dá)(P＜0.05)；海水淹溺組大鼠肺組織AQP5mRNA表達(dá)也顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。 12.地塞米松處理組大鼠，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的釋放、肺泡和肺間質(zhì)水腫、

11、W/D、明顯低于海水淹溺組，仍然高于對(duì)照組；PaO2及PaO2/FiO2明顯高于海水淹溺組；肺組織AQP1，5的表達(dá)積分光密度值顯著高于海水淹溺組(P＜0.05)；肺組織AQP1，5mRNA表達(dá)也顯著高于海水淹溺組(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.海水浸泡對(duì)A549細(xì)胞有損傷作用，但短時(shí)間內(nèi)(16min)無(wú)致死作用。 2.海水浸泡可使A549細(xì)胞細(xì)胞變小，胞膜皺縮，細(xì)胞內(nèi)水外滲，同時(shí)并存AQP1，5表達(dá)上調(diào)，表明A

12、QP1，5參與細(xì)胞內(nèi)外的水平衡調(diào)節(jié)。 3.海水吸入肺內(nèi)可引起大鼠炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的釋放增多，肺泡、肺間質(zhì)水腫，PaO2和PaO2/FiO2下降，表明海水淹溺可引起急性肺損傷。 4.海水淹溺所致大鼠肺損傷時(shí)，隨肺水腫加重，AQP1和AQP5mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明AQP1和AQP5可能與肺水腫的形成過(guò)程有關(guān)。 5.地塞米松可以改善海水淹溺ALI大鼠肺的毛細(xì)血管通透性、肺濕干比值、炎性因子的釋放，