Irisin抑制肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移和小鼠肺損傷炎癥反應(yīng)及作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述。
　　第一部分 Irisin抑制肺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移及作用機(jī)制研究
　　背景：
　　運(yùn)動產(chǎn)生的生物蛋白Irisin已經(jīng)被證實(shí)對多個系統(tǒng)的疾病有保護(hù)性作用，其中包括腫瘤。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的irisin的表達(dá)水平與能量平衡和代謝相關(guān)。近期的一些研究表明，Irisin在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥和粘液癌中起了保護(hù)性作用。多囊卵巢綜合征患者血清中的irisin的基礎(chǔ)表達(dá)水平增高。而在慢性腎臟疾病的患者中

2、，irisin的表達(dá)水平是下降的，和腎小球?yàn)V過率保持一致。乳腺癌患者中irisin的表達(dá)也是下降的。Irisin在多種疾病中被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)能量代謝，免疫調(diào)節(jié)，影響多種疾病的慢性炎癥，包括胃癌。然而，irisin在肺癌中是否扮演者角色尚未知。
　　目的：
　　在肺癌細(xì)胞系細(xì)胞中研究irisin對肺癌細(xì)胞的遷移、增殖以及侵襲的影響，闡明irisin參與肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.人非小細(xì)胞肺癌細(xì)

3、胞系A(chǔ)549和小細(xì)胞細(xì)胞系NCI-H446細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2.MTT法測細(xì)胞增殖。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞遷移。
　　4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞遷移。
　　5.Western blot實(shí)驗(yàn):將不同條件下獲得的細(xì)胞裂解，測定蛋白濃度，調(diào)整到相同濃度后凝膠電泳，抗體孵育后曝光來檢測目的蛋白的表達(dá)。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.Irisin抑制肺癌細(xì)胞的增殖。
　　用M

4、TT法檢測發(fā)現(xiàn)，irisin在20-50nM的濃度范圍內(nèi)能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20nM irisin處理A549細(xì)胞24h，可以顯著抑制細(xì)胞增殖。
　　2.Irisin抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　將20nMirisin加入培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞24h，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移被顯著抑制。
　　3.irisin通過抑制肺癌細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路來抑制EMT的表達(dá)。

5、
　　(1)選擇了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446來完成這個實(shí)驗(yàn)。
　　(2)20nM irisin孵育細(xì)胞24h可以顯著抑制間葉細(xì)胞的標(biāo)記物N-cadherin和vimentin，上調(diào)上皮細(xì)胞的標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)。
　　(3)20nM irisin孵育細(xì)胞24h降低磷酸化PI3K/AKT蛋白、上調(diào)總PI3K/AKT蛋白的表達(dá)，而LY294002作為PI3K抑制劑，完全逆轉(zhuǎn)了以

6、上現(xiàn)象。
　　4.Irisin通過抑制PI3K/AKT信號通路使Snail表達(dá)下調(diào)。
　　(1) Snail通過轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達(dá)，是E-cadherin的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。20nM irisin顯著抑制Snail的表達(dá)。
　　(2)10uM LY29400孵育細(xì)胞2小時，Snail表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果表明irisin通過阻斷PI3K/AKT通路來抑制Snail的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究

7、是首次發(fā)現(xiàn)了irisin和肺癌的關(guān)系。
　　2.Irisin抑制了肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，這種新發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制可能使irisin成為一種新型的抗癌小分子。
　　3.Irisin通過阻斷PI3K/AKT/Snail信號通路抑制了肺癌細(xì)胞的EMT，減緩了肺癌的增殖轉(zhuǎn)移。
　　第二部分 Irisin對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)性作用及機(jī)制研究
　　背景：
　　急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(A

8、RDS)是比較嚴(yán)重的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為過度的炎癥反應(yīng)、膿毒血癥、通氣功能受損、肺毛細(xì)血管彌漫性損傷和肺水腫。ALI的最嚴(yán)重的形式被稱為ARDS。 ALI/ARDS的病人常常出現(xiàn)病情的急性發(fā)作，氧合下降，胸片顯示雙肺磨玻璃影，呼吸頻率增加，肺水腫形成和非心源性的呼吸衰竭，臨床上ALI/ARDS有比較高的發(fā)病率和死亡率。既往研究揭示了導(dǎo)致ALI/ARDS的部分機(jī)制，比如與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)的ROS的堆積，與炎癥信號通路激活有關(guān)的ALI

9、/ARDS發(fā)生的分子機(jī)制包括p-38MAPK，AKT和NF-κB信號通路。
　　Irisin是一個代謝相關(guān)的因子，可以誘導(dǎo)棕色脂肪變，它在肥胖相關(guān)的疾病比如動脈硬化，胰島素抵抗和2型糖尿病中都起到保護(hù)性作用。最近的研究證明在2型糖尿病中，irisin通過調(diào)節(jié)AMPK信號通路促進(jìn)脂肪酸氧化和葡萄糖利用，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路來抑制肝糖原糖異生作用。Irisin通過AMPK-Akt-eNOS-NO信號通路增加乙酰膽堿使血管舒

10、張從而降低血壓。某些研究也揭示了AMPK信號通路參與了irisin在不可預(yù)知的慢性情緒應(yīng)激大鼠的抑郁行為中的調(diào)控。Irisin通過激活A(yù)MPK-PI3K-Akt-eNOS信號通路對糖尿病人的動脈粥樣硬化性血管性疾病有治療作用。Irisin也能夠通過抑制ROS/p38 MAPK/NF-κ B信號通路修復(fù)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。
　　尚未有被報道出來的證據(jù)顯示irisin與ALI/ARDS相關(guān)，本研究假設(shè)在AL

11、I/ARDS發(fā)生的過程中，irisin通過介導(dǎo)與炎癥相關(guān)的信號通路是否可以影響到細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)和纖維增生的表達(dá)來闡述irisin對肺損傷的作用及分子機(jī)制。
　　目的：
　　本研究的目的是探索irisin在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的肺泡上皮細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，以及因此而改變的可能的信號通路變化和分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立急性肺損傷的動物模型:選用年齡6-8周的雄性C57BL/6J小鼠，把L

12、PS配置成濃度為2mg/ml的工作液，然后把LPS用PBS配制成100μl體積，稱量小鼠體重，實(shí)驗(yàn)組以濃度5μg/g予鼻內(nèi)滴注法造模，對照組給予鼻內(nèi)滴注生理鹽水(SAL)，治療組在LPS造模后每天腹腔注射給予純化的irisin，濃度為0.5μg/g。
　　2.纖維化組織HE染色后，圖像分析ALI損傷的程度。
　　3.Smith評分分析肺組織損傷程度。
　　4.用Real-time PCR法來在檢測A549細(xì)胞中，LPS

13、誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。
　　5.蛋白表達(dá)用Western blot方法檢測。
　　6.A549細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　7.用MTT法檢測肺泡上皮細(xì)胞的增殖。
　　8.用TUNEL染色檢測肺泡上皮細(xì)胞的凋亡。
　　9.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　本研究所有數(shù)據(jù)用預(yù)測統(tǒng)計分析軟件SPSS18.0版本分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析，非參數(shù)變量使用U檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.Irisin抑制了細(xì)

14、胞的炎癥反應(yīng)以及小鼠模型中LPS誘導(dǎo)的肺損傷的病理改變。
　　動物實(shí)驗(yàn)獲得LPS誘導(dǎo)ALI的實(shí)驗(yàn)組小鼠和irisin治療組小鼠的肺組織切片，觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)性和肺泡性水腫、出血、透明質(zhì)膜形成和彌散性肺泡損傷，而治療組分析結(jié)果顯示irisin能顯著減輕這些損傷。組織學(xué)Smith評分irisin對于減輕肺組織的損傷呈現(xiàn)時間性和濃度性依賴。
　　2.Irisin抑制了LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的炎癥因子的

15、表達(dá)。
　　A549細(xì)胞用LPS(10μg/ml)刺激后，分別加入不同濃度的irisin(0，10，20和40nM)分別反應(yīng)0，6，12，24和48小時，MTT分析顯示20nM irisin能夠顯著抑制細(xì)胞活性。因此本研究選用20nM的irisn做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。LPS刺激后，A549細(xì)胞中IL-6，MCP-1，IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯上升，而Irisin抑制了這種炎癥表達(dá)。
　　3.在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷

16、中，irisin抑制了細(xì)胞凋亡。
　　在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中用TUNEL檢測顯示凋亡指數(shù)（TUNEL陽性細(xì)胞/DAPI染色細(xì)胞）顯著增加，irisin顯著抑制了細(xì)胞凋亡和caspase-3的表達(dá)，提高了Bcl-2的表達(dá)以及抑制Bax的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明在細(xì)胞研究中，irisin抑制了細(xì)胞凋亡。
　　4.Irisin減弱了LPS-誘導(dǎo)的MAPK和NF-κ B信號通路的激活。
　　用western blot方法分析了

17、irisin在LPS-誘導(dǎo)的激活的MAPK和NF-κB信號通路中的作用，結(jié)果顯示在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中，磷酸化p38和磷酸化的NF-κBp65的表達(dá)升高，而irisin預(yù)處理可以降低這些蛋白的表達(dá)。對核和胞漿的蛋白檢測分析結(jié)果顯示irisin能夠顯著降低NF-κ B(p65)的核表達(dá)，提高其在胞漿內(nèi)的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.Irisin抑制了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的炎癥反應(yīng)。
　　2.Irisin抑制了LPS