水通道蛋白在卵巢上皮性癌中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、卵巢上皮性癌(簡(jiǎn)稱卵巢癌)由于病因及發(fā)病機(jī)制不明，發(fā)病隱匿，70％以上的卵巢癌患者就診時(shí)已屆晚期，治療效果欠佳，積極開(kāi)展卵巢癌病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制研究的意義重大。 細(xì)胞內(nèi)外水平衡是維持生命的關(guān)鍵因素之一，水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)維持細(xì)胞正常代謝具有重要作用。水通道蛋白家族(AQPs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水的跨膜蛋白，廣泛分布于機(jī)體組織細(xì)胞，參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外的平衡。卵巢癌合并腹水是晚期病人的一大臨床表現(xiàn)，是否存在水代謝方面的障礙

2、尚不清楚，目前尚未見(jiàn)水通道蛋白與卵巢癌關(guān)系的報(bào)道。 水通道蛋白AQP1分布廣泛，不僅存在于分泌及吸收上皮細(xì)胞，毛細(xì)血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞中也很豐富，AQP1蛋白表達(dá)與毛細(xì)血管的通透性有關(guān)。AQP5主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物唾液腺、呼吸道黏膜和消化腺等腺體細(xì)胞的頂漿膜，在腺體分泌中有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)敲除AQP1基因的小鼠肺泡-毛細(xì)血管水的交換明顯減少，微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)水的通透性下降了十倍，AQP5基因敲除小鼠肺內(nèi)滲透壓依賴的被動(dòng)性水

3、轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制90％。最近研究證明水通道蛋白過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生及神經(jīng)膠質(zhì)瘤腦水腫有關(guān)。 NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種細(xì)胞中，可與相關(guān)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子特殊DNA序列結(jié)合，調(diào)控多種基因表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。目前已有學(xué)者在AQP5的開(kāi)放閱讀窗上游找到NF-κB啟動(dòng)序列，NF-κB在卵巢癌中是持續(xù)性活化的，但核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否調(diào)控卵巢癌細(xì)胞AQP5蛋白的表達(dá)尚不清楚。 為明確水通道蛋白AQP

4、1和AQP5在卵巢癌中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，本文利用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化、蛋白免疫印跡和PT-PCR技術(shù)從兩個(gè)方面進(jìn)行研究：1.水通道蛋白AQP1和AQP5在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其臨床意義；2.卵巢癌SKOV3細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究。 第一部分AQP1和AQP5蛋白在卵巢上皮性癌的表達(dá)及其臨床意義方法：采用免疫組化、蛋白免疫印跡和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)65例卵巢上皮性腫瘤組織中AQP1和AQP5蛋白及mRNA的表達(dá)，并以

5、13例正常卵巢組織為對(duì)照。結(jié)果：1.AQP1蛋白主要表達(dá)于卵巢上皮性腫瘤和正常卵巢組織的毛細(xì)血管和小血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上；AQP5主要表達(dá)于良性腫瘤細(xì)胞的基底膜，交界性腫瘤細(xì)胞的基底膜和頂漿膜，彌漫分布于卵巢癌細(xì)胞的胞膜上，在卵巢扁平上皮無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)。2.卵巢癌及卵巢交界性上皮性腫瘤組織中AQP1和AQP5蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯高于卵巢良性上皮性腫瘤及正常卵巢組織(P＜0.05)；而卵巢癌與卵巢交界性上皮性腫瘤間、卵巢良性上皮性

6、腫瘤與正常卵巢組織間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3.卵巢癌腹水量≥1000ml者AQP1和AQP5蛋白和mRNA表達(dá)明顯高于腹水量＜500ml者(P＜0.05)，伴淋巴轉(zhuǎn)移者AQP5蛋白水平明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。4.Person相關(guān)分析顯示：AQP1蛋白和mRNA表達(dá)與卵巢癌腹水量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.423，0.429；P＜0.05，P＜0.05)；AQP5蛋白和mRNA表達(dá)水平與卵巢癌腹水量(r=0.441，

7、0.427；P＜0.01，P＜0.05)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.410，0.361；P＜0.05，P＜0.05)。 第二部分卵巢癌SKOV3細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)、MTT、免疫組化和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)卵巢癌腹水、順鉑以及核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑PDTC對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3生長(zhǎng)狀況、AQP5和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65以及其抑制因子IκBα蛋白表達(dá)的影響。 第一節(jié)卵巢癌腹水對(duì)SKOV

8、3細(xì)胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表達(dá)的影響結(jié)果：1.隨著所取囊液或腹水來(lái)自卵巢腫瘤惡性程度的升高，SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)率也明顯增加，惡性組明顯高于交界組(P＜0.001)，交界組明顯高于良性組(P＜0.001)和對(duì)照組(P＜0.01)。2.惡性組NF-κBp65核/漿蛋白比值和胞漿NF-κBp65/IκBα蛋白比值明顯高于對(duì)照組、良性組及交界組(P＜0.05)，但對(duì)照組、良性組和交界組三組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。3.卵

9、巢癌腹水培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)高于良性組和對(duì)照組(P＜0.05)，交界組明顯高于良性組(P＜0.01)，對(duì)照組高于良性組(P＜0.05)。4.Person相關(guān)分析顯示：SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)率與AQP5蛋白表達(dá)、NF-κBp65核/漿蛋白比值和胞漿NF-κBp65/IκBα蛋白比值有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.926，0.878，0.839；P＜0.001，0.001，0.01)；AQP5蛋白表達(dá)與NF-κBp65核/漿蛋白比值

10、和胞漿p65/IκBα蛋白比值呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.658，0.622；P＜0.05，0.05)；NF-κBp65蛋白表達(dá)與IκBα有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.839，P＜0.01)。 第二節(jié)順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表達(dá)的影響結(jié)果：1.隨著順鉑劑量增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞邊緣變鈍、變圓，突觸減少，與鄰近細(xì)胞脫離；SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也逐漸增加，且有時(shí)間及劑量依從性(P＜0.

11、01)。2.隨著順鉑濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)量越來(lái)越少(P＜0.001)，并可見(jiàn)AQP5蛋白表達(dá)于核膜上。3.隨著順鉑濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65和IκBα蛋白表達(dá)越少(P＜0.001)，p65核/漿蛋白比值也明顯下降(P＜0.001)。4.Person相關(guān)分析顯示：順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與AQP5、胞漿和胞核NF-κBp65蛋白表達(dá)以及p65核/漿蛋白比值有明顯的負(fù)相關(guān)

12、關(guān)系(r=-0.598，-0.835，-0.710，-0.815；P＜0.01，0.001，0.01，0.001)；AQP5蛋白表達(dá)與細(xì)胞漿NF-κBp65、IκBα以及p65核/漿蛋白比值呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.894，0.857，0.883；P＜0.001，0.001，0.001)；NF-κBp65蛋白表達(dá)與IκBα有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.934；P＜0.001)。 第三節(jié)PDTC對(duì)SKOV3細(xì)胞AQP5、NF-κBp

13、65以及IκBα蛋白表達(dá)的影響結(jié)果：1.隨著PDTC濃度增高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率越來(lái)越高(P＜0.001)，且有時(shí)間及劑量依從性。2.隨著PDTC濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞漿和胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表達(dá)均明顯減少(P＜0.001)。3.隨著PDTC終濃度增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)逐漸減少(P＜0.001)。4.Person相關(guān)分析顯示：PDTC對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

14、率與AQP5、細(xì)胞漿和胞核NF-κBp65蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.983，-0.716，-0.744；P＜0.001，0.01，0.01)；AQP5蛋白表達(dá)與胞漿和胞核NF-κBp65以及胞漿IκBα呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.668，0.625，0.675；P＜0.05，0.05，0.05)，胞漿NF-κBp65與IκBα蛋白表達(dá)有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.939；P＜0.001)。 結(jié)論：1.AQP1和AQP5

15、蛋白定位于卵巢腫瘤組織中的不同細(xì)胞，前者位于微血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞，后者位于卵巢腫瘤細(xì)胞，說(shuō)明兩者介導(dǎo)卵巢腫瘤組織中不同細(xì)胞的水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。 2.卵巢癌組織中AQP1和AQP5蛋白表達(dá)上調(diào)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。 3.卵巢癌微血管內(nèi)皮AQP1和癌細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá)上調(diào)，可能是卵巢癌腹水產(chǎn)生的原因之一。 4.卵巢癌腹水可激活SKOV3細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，上調(diào)AQP5蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

16、 5.順鉑作用早期，可激活SKOV3細(xì)胞NF-κB，因此化療時(shí)應(yīng)注意藥物劑量和用藥時(shí)間，以防產(chǎn)生耐藥。 6.順鉑作用晚期，可抑制SKOV3細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，下調(diào)AQP5蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。 7.核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑PDTC下調(diào)SKOV3細(xì)胞NF-κBp65及IκBα蛋白表達(dá)，減少NF-κBp65蛋白核移位，抑制細(xì)胞增殖。 8.SKOV3細(xì)胞漿和細(xì)胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表達(dá)是同步的，兩者相互依存