雙歧桿菌胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞β-防御素-2基因表達及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、消化道中定植有大量菌群，消化道上皮細胞與這些菌群直接接觸，是腸道粘膜免疫的第一道防線，其分泌的抗菌肽分子在維持腸道微生態(tài)平衡、抵抗病原菌感染中占有重要地位。人β-防御素-2(hBD-2)是一重要的抗菌肽分子，廣泛表達于皮膚、呼吸道、消化道、泌尿生殖道等粘膜上皮細胞中，具有重要的抗感染功能。hBD-2具有誘導(dǎo)表達的特點，通常情況下腸道上皮細胞不表達hBD-2，但在受到致病因子刺激時，hBD-2的表達量迅速提高，進而發(fā)揮粘膜保護功能。

2、 以往的研究顯示病原菌如腸炎性沙門氏菌，侵襲性大腸桿菌等能夠誘導(dǎo)人腸道上皮細胞hBD-2表達，但是益生菌與抗菌肽之間的關(guān)系還沒有相關(guān)研究，而且hBD-2誘導(dǎo)表達的調(diào)控及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚。雙歧桿菌作為人體主要益生菌之一，參與了宿主的消化、營養(yǎng)、代謝、吸收、免疫及抗感染過程。因此通過探討雙歧桿菌與hBD-2表達之間的關(guān)系，尋找誘導(dǎo)hBD-2基因表達的有效刺激因子，不僅能夠通過提高粘膜局部hBD-2濃度而達到殺滅病原

3、菌的目的，而且有助于在分子水平上揭示機體抗感染免疫防御機制。 本項研究目的是檢測雙歧桿菌對人腸腺上皮細胞hBD-2基因的激活作用并分離其活性組分，進一步探討其受體及其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。 首先，我們研究了雙歧桿菌對人腸腺上皮細胞hBD-2基因的激活作用并分離其活性組分。厭氧培養(yǎng)長雙歧桿菌，采用超聲破碎細胞、超速離心、蛋白萃取方法獲得雙歧桿菌胞壁蛋白質(zhì)成份，分別利用活菌，熱滅活全菌，全細胞壁組分和全細胞壁蛋白組分，刺激人腸腺

4、上皮細胞Caco-2，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(盯-PCR)法和Northern雜交檢測到在正常培養(yǎng)條件下腸道上皮細胞無可見的hBD-2mRNA表達，但在雙歧桿菌菌體、細胞壁和胞壁蛋白刺激下均檢測出顯著的hBD-2mRNA表達；應(yīng)用ELISA檢測結(jié)果顯示，在Caco-2細胞受到雙歧桿菌菌體、細胞壁和胞壁蛋白刺激的上清中hBD-2蛋白顯著升高，免疫組化表明hBD-2主要表達在細胞漿中，Western結(jié)果表明在刺激后的Caco-2細胞上清和細

5、胞裂解蛋白中均檢測到hBD-2的表達。利用分子篩方法分離細胞壁蛋白，依據(jù)分子量大小分為四組，其中一組分子量為35-65kDa細胞壁蛋白活性組分，具有較強的誘導(dǎo)hBD-2表達的作用。 其次，我們研究了雙歧桿菌胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸道上皮細胞hBD-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。WesternBlot結(jié)果顯示，雙歧桿菌胞壁蛋白可使IкB-α發(fā)生降解，磷酸化的IкB-α增多，同時發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)p65表達量也明顯增高，提示雙歧桿菌胞壁蛋白

6、可誘導(dǎo)人腸道上皮細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的活化。為了進一步檢測NF-кB在介導(dǎo)雙歧桿菌胞壁蛋白誘導(dǎo)的人腸道上皮細胞hBD-2基因表達中的作用，依據(jù)hBD-2基因上游調(diào)控序列，我們構(gòu)建了含有NF-кB結(jié)合位點的綠色熒光蛋白重組報告基因質(zhì)粒pEGFP-1/-510hBD-2，并在它的基礎(chǔ)上將NF-кB結(jié)合位點進行突變，構(gòu)建包含突變NF-кB的突變重組質(zhì)粒pEGFP-1/-510mhBD-2。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細胞，雙歧桿菌胞壁蛋白刺

7、激后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與pEGFP-1/-510hBD-2組比較，轉(zhuǎn)染了突變的pEGFP-1/-510mhBD-2組綠色熒光明顯降低，表明NF-кB在雙歧桿菌胞壁蛋白誘導(dǎo)hBD-2的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。WesternBlot方法觀察雙歧桿菌胞壁蛋白刺激腸道上皮細胞后胞內(nèi)MAPK通路的信號分子的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌胞壁蛋白可刺激細胞內(nèi)MAPKs蛋白分子ERK1/2、p38MAPK和JNK發(fā)生磷酸化，證實MAPKs信號傳導(dǎo)通路

8、參與了雙歧桿菌胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸道上皮細胞hBD-2的表達。 由于Toll樣受體(TLRs)在調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)中具有重要的作用，我們進一步探討了TLR介導(dǎo)的信號通路與Caco-2細胞hBD-2刺激表達的關(guān)系。為了提高轉(zhuǎn)基因效率和目的基因的表達，我們利用AdEasy系統(tǒng)成功構(gòu)建了突變pAd-mTLR2及突變pAd-mMyD88腺病毒表達載體，將構(gòu)建的突變重組腺病毒表達載體感染Caco-2細胞株后，可顯著抑制雙歧桿菌胞壁蛋白對細胞hB

9、D-2的誘導(dǎo)效應(yīng)。上述試驗結(jié)果提示雙歧桿菌胞壁蛋白可能以TLR2為其受體，通過MyD88依賴途徑誘導(dǎo)了腸道上皮細胞hBD-2的表達。 最后，為了能夠在蛋白水平檢測hBD-2的表達，我們制備了人hBD-2多克隆抗體。利用原核表達質(zhì)粒pGEX-1λT為載體，將hBD-2成熟肽cDNA片段克隆到載體中，獲得原核表達質(zhì)粒pGEX-1λT-hBD-2。大腸桿菌裂解物經(jīng)親合層析純化后獲得分子量約30kDa的融合蛋白GST-hBD-2，將此融