尾加壓素ⅱ體外促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

1、<p>　　尾加壓素Ⅱ體外促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制</p><p>　　作者：黃秀榕，祁明信，李坤鵬，陳義</p><p>　　【摘要】 　　目的：探討尾加壓素Ⅱ (urotensin Ⅱ, UⅡ) 促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法：采用UⅡ與體外培養(yǎng)的LEC共同孵育，并用4種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻

2、斷劑H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine) 分別作用于LEC，再用3H –胸腺嘧啶（3HTdR）摻入法檢測(cè)LEC增殖的情況。結(jié)果：UⅡ組LEC的3H摻入放射活性顯著高于對(duì)照組(P&lt;0.01)，4種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑組的放射活性與UⅡ組比較均有不同程度的降低(P&lt;0.01，P&lt;0.01)。PD98059 和H7 的阻斷作用強(qiáng)于nicardipine 和W7（F= 13.2

3、51，P&lt;0.01）。 結(jié)論：尾加壓素Ⅱ促進(jìn)LEC增殖是通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制，該作用可被信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑所阻斷。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 尾加壓素Ⅱ；晶狀體上皮細(xì)胞；增殖；細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；后發(fā)性白內(nèi)障</p><p>　　AbstractAIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferati

4、on induced by urotensinⅡ(UⅡ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：UⅡ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separatel

5、y. Then the proliferations of LEC were detected via 3HTdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3HTdR in UⅡ group was higher than that in control group(P&lt;0.01). The radioactivities of 3HTdR in g</p>

6、;<p><b>　　</b></p><p>　　KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract</p><p><b>　　0　引言</b></p><p>　　尾

7、加壓素Ⅱ（urotensin Ⅱ, UⅡ）是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的新型生物活性物質(zhì)。最早由Coulouarn于1998年從人體中克隆出人UⅡ（human urotensin Ⅱ, hUⅡ）[1]。此后的研究表明，體內(nèi)多種組織中含有UⅡ。UⅡ不僅具有強(qiáng)烈的縮血管作用[2] ，而且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等發(fā)生增殖[3]。我們?cè)l(fā)現(xiàn)眼部各組織均含有UⅡ，并發(fā)現(xiàn)U

8、Ⅱ具有促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后發(fā)性白內(nèi)障 (after cataract)是白內(nèi)障囊外摘除聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)后的主要并發(fā)癥。其病理生理機(jī)制是手術(shù)后殘留的LEC發(fā)生增殖、移行，使晶狀體后囊膜發(fā)生混濁導(dǎo)致視力再度下降。我們擬探討UⅡ促進(jìn)LEC增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為防治后發(fā)性白內(nèi)障尋求新的途徑。</p><p><b>　　1　材料和方法

9、</b></p><p><b>　　1.1　材料 </b></p><p>　　無菌操作取健康新鮮小牛眼的晶狀體前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行晶狀體上皮細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。hUⅡ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美國Sigma公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為美國GIBCO

10、公司產(chǎn)品， 3H –胸腺嘧啶（3HTdR）購自上海原子核研究所，2,5二苯基惡唑（PPO）及1,4雙（5苯基惡唑基2）苯（POPOP）為中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，胰蛋白酶（trypsin）購自華美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯為市售分析純產(chǎn)品。本研究采用CO2培養(yǎng)箱（美國FORMA 2111）、倒置研究顯微鏡（日本Olymp

11、us IMT413）、低溫冰箱（日本MDFV5410）、真空泵（美國Nulgene EF006）、微量移液器（法國Gilson）、γ液閃計(jì)數(shù)儀（西安FJ2003PS）。</p><p><b>　　1.2　方法 </b></p><p>　　將實(shí)驗(yàn)分成6組，每組8個(gè)樣本。對(duì)照組在LEC中加入胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液。UⅡ組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為108m

12、ol/L的UⅡ。H7組、PD98059組、W7組和尼卡地平組分別在UⅡ組的基礎(chǔ)上加入4種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑，終濃度分別為H7 105mol/L，PD98059 105mol/L，W7 106mol/L，Nicardipine 105mol/L。取第3代培養(yǎng)的LEC并使細(xì)胞生長同步化。在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組，分別加入hUⅡ和H7，PD98059，W7和尼卡地平。將LEC在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12

13、h后，吸去培養(yǎng)液，每孔分別加入3HTdR（其放射比活性為每孔3.7×104個(gè)/min），繼續(xù)培養(yǎng)12h。吸去培養(yǎng)液，消化細(xì)胞并用真空泵抽濾，將細(xì)胞收集于玻璃纖維膜上。于60℃,30min條件下烘干濾膜，用液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定 3H放射活性。</p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有結(jié)果用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示。各組與對(duì)照組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，各組間數(shù)

14、據(jù)比較采用單因素方差OneWay ANOVA分析。</p><p><b>　　2　結(jié)果</b></p><p>　　UⅡ組LEC的3H摻入放射活性（個(gè)/min）顯著高于對(duì)照組(2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P&lt;0.01)，說明UⅡ使LEC發(fā)生明顯的增殖。4種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑組的放射活性與UⅡ組比較均

15、有不同程度的降低(1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P&lt;0.01, P&lt;0.01)，顯示這4組LEC的增殖減少，表明4種阻斷劑均不同程度地阻斷了UⅡ促進(jìn)LEC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在4種阻斷劑中，PD98059組和H7 組的放射活性顯著低于W7組和Nicardipine組（F=13.251，P&l

16、t;0.01），表明PD98059組和H7 組對(duì)UⅡ促進(jìn)LEC增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的阻斷作用更強(qiáng)（表1）。表13HTdR摻入法檢測(cè)4種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑對(duì)UⅡ誘導(dǎo)LEC增殖的影響 (略)</p><p><b>　　3　討論</b></p><p>　　UⅡ是一種生長抑素樣環(huán)型結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，最早提取自魚的尾部下垂體，1998年首次從人體克隆出來。研究表明，UⅡ

17、是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的新型生物活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的促進(jìn)多種細(xì)胞增殖的作用。UⅡ可刺激離體培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)發(fā)生增殖，呈濃度依賴關(guān)系；降鈣素基因相關(guān)肽、腎上腺髓質(zhì)素、IL10等均能抑制由UⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖；UⅡ上調(diào)VSMC內(nèi)皮素基因表達(dá)并促進(jìn)VSMC內(nèi)皮素的合成釋放；腎上腺髓質(zhì)素可濃度依賴性地抑制UⅡ刺激的VSMC內(nèi)皮素mRNA水平的增加[4

18、6]。還有報(bào)道UⅡ能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠心肌成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞發(fā)生增殖，且在一定的濃度范圍內(nèi)其促增殖作用具有濃度依賴性。有關(guān)UⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已有報(bào)道[7]，UⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖的途徑與Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有密切關(guān)系。另有文獻(xiàn)指出[8]，抑制與有絲分裂有關(guān)的多種信號(hào)蛋白分子，如csrc，PKC(protein kinase C)，CaMPK，MAPK(mitogen activated pr

19、otei</p><p>　　我們?cè)l(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)各組織中均有一定量的UⅡ，UⅡ能顯著促進(jìn)LEC發(fā)生明顯的增殖并呈濃度依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，我們采用3HTdR摻入法檢測(cè)4種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑對(duì)UⅡ促進(jìn)LEC增殖的影響，以探討UⅡ促進(jìn)LEC 增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。這4種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制劑，PD98059是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑，W7是鈣調(diào)素（CaM）抑制劑，尼卡地平

20、(Nicardipine)是鈣通道阻滯劑。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑均能降低LEC的放射活性、阻斷UⅡ促進(jìn)LEC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使UⅡ促進(jìn)LEC增殖的作用減弱。間接表明UⅡ是通過DG蛋白激酶C途徑、受體酪氨酸蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶途徑、Ca2+和鈣調(diào)蛋白激酶途徑等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其促進(jìn)LEC增殖的作用，從而探明了UⅡ促進(jìn)LEC增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。</p><p>　　白內(nèi)障囊外摘除

21、聯(lián)合人工晶狀體植入手術(shù)后殘留的LEC發(fā)生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶狀體結(jié)構(gòu)如珍珠樣（Elschnig）小體及Soemmering環(huán)，再向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分泌膠原形成纖維膜, 使晶狀體后囊膜發(fā)生混濁，導(dǎo)致白內(nèi)障術(shù)后視力再度下降。這是后發(fā)性白內(nèi)障的主要病理生理過程。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)UⅡ能促進(jìn)LEC增殖，提出其很可能是后發(fā)性白內(nèi)障的一個(gè)重要發(fā)生機(jī)制。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑均能阻斷UⅡ促進(jìn)LEC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

22、，使UⅡ促進(jìn)LEC增殖作用減弱。該結(jié)果一方面表明UⅡ促進(jìn)LEC增殖的作用及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，闡明了后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制；另一方面揭示采用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑可阻斷UⅡ促LEC增殖作用，減少白內(nèi)障手術(shù)后的后囊膜混濁，提出這可能是防治后發(fā)性白內(nèi)障的一個(gè)新途徑。經(jīng)廣泛查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，有關(guān)UⅡ促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞等眼內(nèi)組織細(xì)胞增殖的研究尚未見報(bào)道，更未見UⅡ促進(jìn)LEC增殖作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究報(bào)道，本研究具有一定的科學(xué)意義和

23、應(yīng)用前景。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　1　Matsushita M, Shichiri M, Fukai N, et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. End

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27、　7　強(qiáng)正浩, 張孫曦, 李菊香, 等. 鈣信號(hào)在尾加壓素II促血管平滑肌增殖中的作用．北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2002; 34(3):261265</p><p>　　8　陳亞紅, 趙鳴武, 夏春芳, 等. 尾加壓素在大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制．中華醫(yī)學(xué)雜志 2002;80(12):928930</p><p>　　9　Watanabe T, Pakala R, Kata