調控人羊膜上皮細胞AQP3表達的cAMP-PKA信號轉導通路的研究.pdf

1、目的:在前期研究中，發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細胞水通道蛋白3(AQP3)的表達與羊水量異常相關，但其調控機制未明。通過研究調控人羊膜上皮細胞AQP3表達的環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號轉導通路，明確人羊膜上皮細胞中AQP3表達的調控機制，為臨床上治療羊水量異常提供新思路。
　　 方法:(1)體外原代培養(yǎng)足月妊娠羊水量正常的人羊膜上皮細胞。(2)分別用①cAMP激動劑Forskolin處理人羊膜上皮細胞，不同濃度Forsko

2、lin(0、2.5、5、50、100μmol/L)作用2h和最佳濃度Forskolin不同作用時間(0、1、2、10、20h)。同時加入等量的DMS0作為溶劑對照組。②PKA激動劑SP-cAMP處理人羊膜上皮細胞，不同濃度SP-cAMP(0、2.5、5、50、100μmol/L)作用2h和最佳濃度SP-cAMP不同作用時間(0、1、2、10、20h)。③PKA抑制劑H-89處理人羊膜上皮細胞，不同濃度H-89(0、5、10、50、100

3、μmol/L)作用2h和最佳濃度H-89不同作用時間(0、1、2、10、20h)。以上①②③不同作用時間組設置空白對照，不同濃度組采用CCK-8法檢測細胞增殖率。④最佳濃度的Forskolin+最佳濃度H-89處理人羊膜上皮細胞2h。(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定Forskolin、SP-cAMP和H-89作用前后人羊膜上皮細胞內cAMP含量及PKA活性表達變化。(4)采用免疫細胞化學染色方法檢測AQP3蛋白在人羊膜上皮細胞

4、中的定位。(5)采用蛋白質印跡技術檢測人羊膜上皮細胞中總CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和AQP3蛋白表達水平。
　　 結果:(1)免疫細胞化學染色方法發(fā)現(xiàn)AQP3蛋白表達于人羊膜上皮細胞的胞漿及胞膜，以胞漿為主，F(xiàn)orskolin、SP-cAMP和H-89不同濃度和不同時間作用后，AQP3表達定位未見明顯變化。(2)不同濃度Forskolin、SP-cAMP和H-89作用人羊膜上皮細胞的細胞增殖率無顯著性差異。(3)空

5、白對照組細胞內cAMP含量、PKA活性、總CREB、p-CREB和AQP3蛋白表達在不同作用時間均未見顯著性差異。(4) cAMP含量、PKA活性、p-CREB和AQP3蛋白表達，在5μmol/L Forskolin作用2h組較0μmol/L作用2h組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義;最佳濃度Forskolin作用10h組比0h組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義。總CREB表達在各濃度組和各時間組均無顯著性差異。(5) PKA活性、p-CREB和A

6、QP3蛋白表達，在SP-cAMP50μmol/L作用2h組較0μmol/L作用2h組顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義;最佳濃度SP-cAMP作用10h組比0h組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義。cAMP含量及總CREB表達在各濃度組和各時間組均無顯著性差異。(6)PKA活性、p-CREB和AQP3蛋白表達，在H-8910μmol/L作用2h組較0μmol/L作用2h組明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義;最佳濃度H-89作用2h組較0h組明顯下調，差異有統(tǒng)計

7、學意義。cAMP含量及總CREB表達在各濃度組和各時間組均無顯著性差異。(7) Forskolin+H-89處理人羊膜上皮細胞2h后，p-CREB和AQP3蛋白表達較Forskolin處理組明顯下調，但高于H-89處理組，差異有統(tǒng)計學意義。總CREB表達無顯著性差異。
　　 結論:(1) AQP3蛋白表達于人羊膜上皮細胞的胞漿及胞膜，以胞漿為主。(2)Forskolin能夠上調人羊膜上皮細胞中cAMP含量、PKA活性、p-CRE

8、B表達水平，進而上調人羊膜上皮細胞中AQP3蛋白的表達水平，提示Forskolin可能通過激活cAMP-PKA信號轉導通路來調節(jié)人羊膜上皮細胞中AQP3蛋白表達水平。(3)SP-cAMP能夠上調人羊膜上皮細胞中PKA活性、p-CREB表達水平，進而上調人羊膜上皮細胞中AQP3蛋白的表達水平，提示SP-cAMP可能通過激活PKA途徑來調節(jié)人羊膜上皮細胞中AQP3蛋白表達水平。(4)H-89能夠下調入羊膜上皮細胞中PKA活性、p-CREB表