三氧化二砷誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、目的： 肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，人們都在努力尋找新的抗癌制劑或化療方案以期提高肺癌的治愈率。肺癌已成為大城市中最常見的惡性腫瘤之一?；瘜W(xué)治療目前仍然是肺癌綜合治療的主要手段，細(xì)胞毒類藥物主要?dú)[瘤群體中的敏感細(xì)胞，原發(fā)或繼發(fā)耐藥細(xì)胞則是腫瘤復(fù)發(fā)與/或轉(zhuǎn)移的根源。國內(nèi)外學(xué)者一直在尋找更有效的化療藥物以解決不斷出現(xiàn)的耐藥和復(fù)發(fā)問題。 我國學(xué)者成功應(yīng)用三氧化二砷(AS203)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acut

2、e Promyelocytic Leukemia，APL)，引起了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的極大興趣。AS2O3對于其抗癌作用的研究，已經(jīng)從血液系統(tǒng)腫瘤進(jìn)入實(shí)體腫瘤，先后相繼開展了AS2O3抗消化道腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤以及泌尿系統(tǒng)腫瘤作用及其機(jī)制的研究。國內(nèi)外研究表明，三氧化二砷具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成，選擇性抑制白血病細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡的作用。 腫瘤細(xì)胞凋亡凋亡途徑由Caspase家族蛋白酶介導(dǎo)和執(zhí)行。

3、Caspase家族在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中作為重要的效應(yīng)子執(zhí)行凋亡。Caspase激活的凋亡有外源性和內(nèi)源性兩條途徑，外源性途徑通過細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)，內(nèi)源性途徑即線粒體信號通路由bax/bcl—2通路的活化而啟動，兩條途徑均導(dǎo)致Caspases級聯(lián)激活，最終活化Caspase—3。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)通過與Caspase相互作用來抑制細(xì)胞凋亡，Survivin是IAPs

4、家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤均高表達(dá)。Survivin通過直接抑制Caspase—3和Caspase—7的活性發(fā)揮抗凋亡作用。目前三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡過程中的Survivin及Caspase—3的作用目前尚未見報(bào)道。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen—Activated Protein Kinases，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞外信號引起核反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞的共同通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)

5、激酶(Extracellular signal—regulated kinases，ERK)、C—JUN氨基末端激酶(c—jun N-Terminal kinases，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen—Activated Protein Kinases，p38)三個(gè)主要成員。多種細(xì)胞外刺激均可將信號傳至細(xì)胞內(nèi)，引起MAPK系統(tǒng)激酶連鎖磷酸化。已有證據(jù)顯示，MAPK信號傳導(dǎo)通路的異常與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡關(guān)系

6、密切。ERK1和ERK2是ERK中的兩個(gè)重要成員，磷酸化的ERK(P—ERK)是其活化形式，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等生理過程，其中Ras—Raf—1—MEK1/2—ERK1/2通路是細(xì)胞外有絲分裂信號引起細(xì)胞增殖的共同通路。國外研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，MEK抑制劑PD98059通過抑制ERK活性進(jìn)而抑制腫瘤生長，抑制MEK/ERK的活力可以放大紫杉醇、順鉑等化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。目前有關(guān)三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H157

7、細(xì)胞凋亡過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究并無報(bào)道。 為進(jìn)一步明確三氧化二砷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的確切機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬采用三氧化二砷作用于非小細(xì)胞肺癌NCI—H157細(xì)胞，觀察三氧化二砷對NCI—H157細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，進(jìn)一步研究三氧化二砷在誘導(dǎo)凋亡過程中對Survivin基因表達(dá)及Caspase—3的影響，闡述MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在三氧化二砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的可能機(jī)制。 方法： 1、細(xì)胞增殖測定： 采用M

8、TT法檢測細(xì)胞生長指數(shù)，繪制增殖曲線。 2、細(xì)胞凋亡的檢測： 吖啶橙熒光染色形態(tài)學(xué)分析及流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量檢測細(xì)胞凋亡。透射電鏡等技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 3、RT-PCR： 檢測Survivin mRNA表達(dá)。 4、Western Blot： 檢測Survivin、Caspase—3蛋白及p—ERK1/2蛋白。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，結(jié)

9、果進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果： 1、三氧化二砷對NCI—H157細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用 三氧化二砷以時(shí)間、劑量依賴的方式抑制NCI—H157細(xì)胞增殖，24h、48h和72h抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別為11.6μmol/L、8.lμmol/L及5.8μmol/L。 2、三氧化二砷在誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡過程中對Survivin基因表達(dá)、C

10、aspase—3的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，5μmol/L三氧化二砷作用12h～48h Survivin mRNA表達(dá)逐漸下降。Western Blot解析結(jié)果顯示，Survivin蛋白表達(dá)在5μmol/L三氧化二砷處理后逐漸下調(diào)，處理24h后出現(xiàn)17KD Capase—3的活性亞基，直至72h。 3、ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡過程的影響 (1)PD98059促進(jìn)三氧化二砷對N

11、CI—H157細(xì)胞增殖抑制作用 預(yù)先用20μmol/L PD98059處理NCI—H157細(xì)胞1小時(shí)，然后加入5μmol/L的三氧化二砷繼續(xù)作用24 h、48 h、72h，加用PD98059后，24 h、48 h、72h細(xì)胞的增殖率分別由77.4％、59.2％、30.2％下降至62.7％、43.6％和16.1％(P<0.05)，提示PD98059促進(jìn)了三氧化二砷對NCI—H157細(xì)胞增殖抑制作用。 (2) PD98059

12、增強(qiáng)三氧化二砷對NCI—H157細(xì)胞凋亡作用 ①單用20μmol/L的PD98059作用NCI—H157細(xì)胞24h，形態(tài)學(xué)可見細(xì)胞生長良好，未見到凋亡改變。單用5μmol/L的三氧化二砷作用NCI—H157細(xì)胞24h始，形態(tài)學(xué)觀察可見細(xì)胞凋亡改變，用20μmol/L的PD98059預(yù)先處理NCI—H157細(xì)胞1h，然后加入5μmol/L的三氧化二砷繼續(xù)共同孵育24h，同單用三氧化二砷組比，形態(tài)學(xué)凋亡改變更加明顯。流式細(xì)胞儀分析提

13、示，同單用三氧化二砷組比較，聯(lián)合應(yīng)用組處理NCI—H157細(xì)胞24h，亞G1期細(xì)胞比例由20.5％增加至39.3％(P<0.05)。 ②三氧化二砷5μmol/L分別處理NCI—H157細(xì)胞5min～72h，Western Blot解析結(jié)果顯示，p—ERK1/2蛋白在5 min即可出現(xiàn)，表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)至3h，后逐漸減弱，至72 h后消失。20μmol/L PD98059預(yù)先處理NCI—H157細(xì)胞1h后，加入三氧化二砷5μmol/L

14、繼續(xù)處理至24 h，未檢測到p—ERK1/2 MAPK蛋白的表達(dá)，提示三氧化二砷可以活化ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 ③20μmol/LPD98059預(yù)先處理NCI—H157細(xì)胞1 h后加入三氧化二砷5μmol/L共同孵育至24 h，Survivin mRNA表達(dá)由單用三氧化二砷組59.4％，降至聯(lián)合應(yīng)用的29.6％。Western Blot解析結(jié)果顯示，Survivin蛋白的表達(dá)水平由單用三氧化二砷組的56.8％下調(diào)至聯(lián)合組22.8％

15、(P<0.01)。非激活狀態(tài)32KD的proCaspase—3由單用三氧化二砷組的46.5％下調(diào)至12.8％，17KD的活性亞基明顯增加(P<0.01)，表明PD98059阻斷ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)了三氧化二砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)的Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)和Caspase—3活化。 結(jié)論： 1.三氧化二砷以時(shí)間、劑量依賴的方式抑制NCI—H157細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡。 2.三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H

16、157細(xì)胞凋亡過程中下調(diào)Survivin mRNA及蛋白表達(dá)，并活化Caspases—3，提示三氧化二砷誘導(dǎo)的NCI—H157細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)Survivin基因表達(dá)及活化Caspase—3有關(guān)。 3.抑制ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步下調(diào)Survivin表達(dá)、活化Caspase—3，提示ERK途徑可能參與了三氧化二砷誘導(dǎo)NCI—H157細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，抑制該途徑，可起到增強(qiáng)三氧