EGCG對(duì)人皮膚細(xì)胞的輻射防護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究EGCG對(duì)人皮膚HaCaT細(xì)胞放射敏感性的影響，進(jìn)一步探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸脂（EGCG）對(duì)人正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞 HaCaT的輻射保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法:選取人永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。（1）利用四氮唑鹽比色試驗(yàn)（MTT）測(cè)定EGCG或聯(lián)合X射線對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響，篩選出合適的EGCG的濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；（2）給予不同劑量X射線照射，應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)EGCG對(duì)HaCaT細(xì)胞存活

2、分?jǐn)?shù)及放射敏感性的影響；（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGCG聯(lián)合X射線作用后，HaCaT細(xì)胞凋亡及周期分布的改變情況；（4）熒光顯微鏡觀察EGCG聯(lián)合X射線后HaCaT細(xì)胞線粒體及ROS的變化；（5）應(yīng)用Western-blot法分析EGCG聯(lián)合X射線作用后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白 HO-1、SOD等的表達(dá)水平的變化；（6）免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nrf2表達(dá)變化；（7）MTT法檢測(cè)HO-1 siRNA或SnPP聯(lián)合EGC

3、G后輻射防護(hù)作用；（8）熒光素酶活性檢測(cè) HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)；（9）免疫組化法觀察 EGCG對(duì)皮膚的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　結(jié)果:（1）MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：EGCG在0-75μmol/L濃度范圍內(nèi)聯(lián)合X射線可減輕輻射導(dǎo)致的 HaCaT細(xì)胞活力下降，而沒(méi)有明顯毒性作用；（2）細(xì)胞輻射敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：EGCG聯(lián)合輻射組細(xì)胞相比單純照射組，細(xì)胞克隆形成率均明顯提高（P<0.01）。對(duì)于HaCaT細(xì)胞，單純照射組和藥物+照射組平均致死劑量（D

4、0）值分別為2.43Gy、2.63Gy，準(zhǔn)閾劑量（Dq）值分別為1.78Gy、2.53Gy；（3）AnnexinⅤ/PI雙染法凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)于HaCaT細(xì)胞，單純10、20Gy照射組細(xì)胞凋亡率分別是9.25%和12.41%，10Gy組經(jīng)50μM EGCG處理后，細(xì)胞凋亡率分別降低至7.82%和10.24%，20Gy組經(jīng)50μM EGCG處理后，細(xì)胞凋亡率分別降低至6.34%和8.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；流式細(xì)胞儀

5、分析細(xì)胞周期顯示：在照射劑量點(diǎn)，對(duì)于HaCaT細(xì)胞，EGCG+照射組與單純照射組相比，G0/G1期細(xì)胞比例上升（p<0.01），G2/M期細(xì)胞比例下降，G2期阻滯緩解，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；（5）Western-blot分析顯示：對(duì)HaCaT細(xì)胞，與單純照射組相比，EGCG+照射組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)水平增加，而細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白HO-1的表達(dá)量上升，而SOD沒(méi)有明顯改變；（6）免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

6、顯示：EGCG+照射組HaCaT細(xì)胞使Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子向核內(nèi)轉(zhuǎn)移；（6） MTT法顯示HO-1 siRNA或SnPP聯(lián)合EGCG后輻射防護(hù)作用減輕；（7）熒光素酶活性檢測(cè)EGCG可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)；（8）免疫組化法觀察EGCG可誘導(dǎo)大鼠皮膚組織的HO-1的表達(dá)。
　　結(jié)論:EGCG對(duì)人皮膚HaCaT細(xì)胞具有輻射保護(hù)作用，EGCG可能通過(guò)清除X射線引起的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的自由基，緩解G2期阻滯，改變凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、B